[發(fā)明專利]alpha?酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法及其在生物樣本中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610050322.6
• 申請(qǐng)日: 2016-01-26
• 公開（公告）號(hào): CN105503768B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳光;周偉;趙晨陽;付強(qiáng);王亦琳;李秀;劉玉霞;王樺;張書圣;尤進(jìn)茂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 曲阜師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07D271/12
• 分類號(hào): C07D271/12;G01N21/33;G01N21/64
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所37218
• 代理人: 李桂存

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法及其在生物樣本中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，針對(duì)alpha-酮戊二酸的分析化學(xué)方法主要包括氣相（GC）、高效液相色譜(HPLC)與質(zhì)譜（MS）、紫外檢測器（UV-detector）等。而熒光分子探針檢測方法數(shù)量甚少，包括利用硝基苯并噻二唑肼（nitrobenzothiadiazole hydrazine DT）和 萘酰亞胺肼取代物（hydrazino-substituted naphthalimide）熒光分子探針對(duì)alpha-酮戊二酸進(jìn)行監(jiān)測。

色譜檢測方法已經(jīng)在很多領(lǐng)域得以應(yīng)用，但對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)生物樣本的快速批量檢測來說并不是最好的選擇。其原因在于：首先，技術(shù)步驟復(fù)雜，樣品處理步驟繁多、工作量大、操作時(shí)間長、效率低下等。這對(duì)于醫(yī)學(xué)生物樣本，特別是活細(xì)胞、活體檢測是完全沒有可能實(shí)現(xiàn)的。其次，樣品需求量大，試劑消耗量大。生物樣本的特點(diǎn)在于樣本量微小，而色譜聯(lián)合大型儀器檢測的方法則往往需要預(yù)處理較大數(shù)量的待測樣本來達(dá)到目標(biāo)物純化、富集、分離的目的，因此并不適用于微量樣本分析。最后，大型儀器本身成本高，且操作往往步驟縝密，不易于掌握和推廣，在高效率快節(jié)奏的現(xiàn)代社會(huì)，此類方法的應(yīng)用似乎達(dá)到了發(fā)展的瓶頸期。

熒光分子探針檢測主要通過設(shè)計(jì)熒光分子探針對(duì)待測物進(jìn)行高度選擇檢測，從而產(chǎn)生熒光響應(yīng)的改變，并利用光學(xué)信號(hào)的差異性質(zhì)來對(duì)待測物進(jìn)行高靈敏檢測。步驟大體概括為：分子設(shè)計(jì)、樣品檢測等。基于熒光分子探針的檢測與應(yīng)用是分析技術(shù)中比較新穎的技術(shù)，其原理在于通過分子設(shè)計(jì)思想，將發(fā)光基團(tuán)與反應(yīng)基團(tuán)連接得到分子探針。檢測時(shí)，探針通過反應(yīng)基團(tuán)的特異性反應(yīng)來識(shí)別目標(biāo)物，分子結(jié)構(gòu)的改變將對(duì)發(fā)光基團(tuán)造成影響，使熒光信號(hào)發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測或生物成像。從其檢測原理可見此類方法優(yōu)勢(shì)在于選擇性好，不需要待測物分離，操作簡便，適于樣品的批量分析。所以該方法在生命分析研究領(lǐng)域備受推崇。然而，對(duì)于alpha-酮戊二酸，此類方法非常少見，說明學(xué)術(shù)界目前的研究程度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。從目前所報(bào)導(dǎo)的兩種方法來看，存在如下缺限：

首先，熒光響應(yīng)差，靈敏度較低，發(fā)光原理不利于生物樣本檢測。從現(xiàn)有報(bào)導(dǎo)來看，現(xiàn)有探針與待測物alpha-酮戊二酸反應(yīng)后，熒光增強(qiáng)約7-9倍，很難實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測。雖然借助添加表面活性劑的方法來實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng)，但這種方法將破壞生物環(huán)境同時(shí)會(huì)帶來較大的誤差，因而并不適于生物樣本的實(shí)際檢測。因此，探針本身的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有待改進(jìn)。

其次，檢測準(zhǔn)確性、精確密等指標(biāo)有待改善。眾所周知，相對(duì)于大型儀器較高的信號(hào)穩(wěn)定性，生物傳感往往帶來較大誤差。雖然熒光探針的信號(hào)自校正功能可有效改善這一缺點(diǎn)。但現(xiàn)有報(bào)導(dǎo)并沒有對(duì)這一缺點(diǎn)實(shí)施改善。并且現(xiàn)有探針分子發(fā)光原理不利于分子熒光的強(qiáng)烈增加。所以，探針的功能性設(shè)計(jì)及發(fā)光機(jī)理均有待改進(jìn)。

再次，檢測的便捷程度仍有待提高。目前，生命有機(jī)分析檢測領(lǐng)域中涌現(xiàn)出很多快捷方便的檢測手段，包括比色法、肉眼監(jiān)測等等。這些方法已在細(xì)胞分析、活體監(jiān)測等領(lǐng)域廣為使用，但alpha-酮戊二酸的比色/肉眼觀測技術(shù)卻依然處于研究的空白。因此，將檢測方法進(jìn)一步改善，將實(shí)驗(yàn)操作的便捷程度繼續(xù)提高是alpha-酮戊二酸檢測方法開發(fā)的實(shí)際需求。

最后，缺乏對(duì)alpha-酮戊二酸成像技術(shù)的研究。細(xì)胞/組織成像技術(shù)是熒光探針優(yōu)勢(shì)的獨(dú)特體現(xiàn)。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)疾病的可視化監(jiān)測與治療，對(duì)于癌癥等重大疾病的發(fā)現(xiàn)與診斷有著非凡的意義。但前人所報(bào)導(dǎo)的方法中并未涉及這一技術(shù)及應(yīng)用。因而，開發(fā)適于細(xì)胞成像的分子探針，建立可視化監(jiān)測平臺(tái)將從本質(zhì)上改變alpha-酮戊二酸的研究方式，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)alpha-酮戊二酸所致癌癥疾病的可視化研究。因此，成像技術(shù)及應(yīng)用亟待開展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種alpha-酮戊二酸的熒光/紫外分子探針的制備方法，制備得到的分子探針可應(yīng)用于生物樣本檢測，具有響應(yīng)性好、數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，設(shè)備便捷易操作，可實(shí)施性強(qiáng)，特別適合大批量樣本組合篩選等大數(shù)據(jù)研究。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：