[發明專利]快速檢測豬細小病毒的實時熒光RPA試劑盒、試紙條RPA試劑盒及其用途

有效

• 申請號: 201610049300.8
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105603123B
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 楊洋;張志東;秦曉東
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 11139 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種快速檢測豬細小病毒(PPV)的實時熒光RPA(PPV real?time RPA)試劑盒及其用途，還公開了一種快速檢測PPV的試紙條RPA(LFS RPA)試劑盒及其用途。該兩種試劑盒分別包括SEQ ID NO.1及2所示的引物及各自的探針，雖然針對同一靶標序列，但引物和探針的修飾堿基和檢測平臺不同。實驗證明本發明的兩個試劑盒的敏感性均為10²拷貝/反應，并均只能特異性檢測PPV。分別用本發明的兩個試劑盒檢測PPV疑似樣品，結果表明這兩個試劑盒的檢測結果與qPCR均具有很高的符合度。因此，本發明的兩個試劑盒均能快捷、高效、靈敏的檢測PPV，為PPV的鑒別診斷提供了有效技術手段。

技術領域

本發明涉及一種檢測豬細小病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種基于RPA反應的用于快速檢測豬細小病毒的實時熒光RPA試劑盒以及試紙條RPA試劑盒，還涉及二者在快速檢測豬細小病毒中的用途，本發明屬于預防獸醫學檢驗領域。

背景技術

自PCR技術誕生以來已經有三十年了。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術需要特殊昂貴的熱循環儀器以及熟練的操作人員，費時費力，難以用在現場診斷以及實驗條件差的地方。在發展中國家實驗室中，由于PCR實施所需要的基礎設備和技術所限，大多數發展中國家仍然集中在使用傳統的試驗方法，比如血清學方法、顯微鏡技術，或者培養以及鑒定傳染性以及非傳染性疾病。為了填補傳統方法和PCR之間的空缺，新的等溫分子診斷技術正在開發，該方法尤其適用于基礎設施、實驗設備以及試驗技術難于支持使用PCR進行診斷的地方。

英國TwistDx Inc公司開發的重組酶聚合酶擴增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。以此為基礎的核酸擴增產品能夠在15分鐘內，37℃-42℃之間進行核酸檢測。現在使用最多的、最為成熟的為進行實時監控的體系(如exo試劑盒，real-time RPA)以及基于試紙條的終點檢測(nfo試劑盒，Recombinase Polymerase Amplification Assaycombined with lateral flow test，LFS RPA)。

實時熒光RPA(real-time RPA)試驗需要能激發并檢測熒光基團的恒溫儀器，比如酶標儀或實時檢測的熱循環儀。自開發以來，該技術已經被廣泛的應用到人類疾病、獸醫藥物、食品工業以及農業中，比如用于土拉弗朗西斯菌、細螺旋體、HIV-1DNA、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、天花病毒、B型鏈球菌、大腸桿菌產生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病毒性腹瀉病毒、黃熱病毒以及戈登病毒等病原的檢測。

對于試紙條RPA(LFS RPA)試驗而言，只要溫度能控制在37-42℃之間就行，比如可以在水浴鍋等設置中進行反應，或者直接用人的體溫進行加熱，隨后可以通過側流層析試紙條LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)讀取試驗結果。自開發以來，該技術已經被廣泛的應用到人類疾病、獸醫藥物、食品工業以及農業中，比如用于感染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、惡性瘧原蟲、洋李痘皰病毒、羌蟲、力克次體、隱孢子蟲以及黃熱病毒等的檢測。與常規方法相比較，該實驗具有很高的敏感性和特異性。

與常規方法相比較，等溫擴增實驗具有很高的敏感性和特異性，這些原因促使不同的公司商業化不同的等溫擴增技術，比如，環介導的擴增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，鏈置換擴增(strand displacement amplification,BectonDickson,USA)。在這些技術中，LAMP是使用最為廣泛，且最成熟的試驗方法。與RPA方法相比較，LAMP技術具有試驗設計比較麻煩(3對引物)，特異性相對較弱(能擴增很多條帶)，時間仍然相對較長，以及易于污染等不足的地方。