[發明專利]一組用于腸癌早期診斷的NDRG4基因甲基化檢測引物和探針及其試劑盒

有效

• 申請號: 201610048731.2
• 申請日: 2016-01-23
• 公開（公告）號: CN105543378A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 鄒鴻志;吳珊;牛智通;趙榮淞;余浩
• 申請（專利權）人: 廣州市康立明生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域。更具體地，涉及一組用于腸癌早期診斷的NDRG4基 因甲基化檢測引物和探針及其檢測試劑盒。

背景技術

大腸癌(colorectalcancer，CRC)是臨床最常見的惡性腫瘤之一，近些年隨著經 濟的發展，人們的生活方式尤其是飲食結構的變化，腸癌已經成為我國發病率上升最快的 惡性腫瘤之一，嚴重威脅著國人的生命和健康。而且，晚期患者預后很差，目前，對腸癌進行 早期診斷早期治療以提高腸癌的治愈率，降低死亡率，已經成為迫切的需要。

DNA甲基化常常是腫瘤發生發展過程中的早期事件，因此，特異基因的甲基化可作 為腫瘤早期診斷的分子標志物。NDRG4(N-mycdownstream-reguiatedgene4)為抑癌基因 NDRG基因家族成員之一，NDRG4基因長32kb，由17個外顯子及16個內含子組成，大量研究表 明該基因與腫瘤細胞的生長、分化和轉移有一定關系，其基因5’端調控區域含有CpG島，在 結直腸癌發生發展過程中常常被甲基化，NDRG4基因甲基化被認為是結直腸癌的重要生物 學特征(Veerie等)。因此，NDRG4基因是候選腫瘤抑制基因和直腸癌的潛在生物標志物， NDRG4啟動子的甲基化可作為生物標志物，用于早期診斷結直腸癌。

而對于NDRG4基因甲基化的檢測而言，檢測敏感性和特異性是尤其至關重要的因 素，對腸癌早期診斷的準確判斷具有重要的意義。而檢測敏感性和特異性受多方面因素的 影響，因此，對于保證和提高NDRG4基因甲基化檢測敏感性和特異性的相關研究，是利用該 基因進行腸癌早期診斷的重點和難點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有利用NDRG4基因檢測進行腸癌早期診斷技術 的不足和缺陷，提供一種高敏感性、高特異性的NDRG4基因甲基化檢測引物和探針，而且檢 測樣本可使用方便獲取處理的糞便樣品，非常適用于臨床篩查，對腸癌的早期診斷具有重 要的意義。

本發明的目的是提供一組用于腸癌早期診斷的NDRG4基因甲基化檢測引物和探針

本發明的另一目的是提供一種利用上述引物和探針制備出的NDRG4基因甲基化檢 測試劑盒。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一組用于腸癌早期診斷的NDRG4基因甲基化檢測引物和探針，所述引物為NDRG4- 1FP和NDRG4-1RP，其核苷酸序列分別如SEQIDNO.1和2所示；所述探針為NDRG4-2Pb，其核 苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

一種用于腸癌早期診斷的NDRG4基因甲基化檢測試劑盒，包含有上述引物NDRG4- 1FP、NDRG4-1RP和探針NDRG4-2Pb。

進一步地，上述試劑盒還包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針NDRG4-2Pb進 行PCR擴增時，獲得PCR模板所需試劑，所需試劑包括提取待測樣品DNA時捕獲目的片段的捕 獲探針NDRG4-CP，捕獲探針NDRG4-CP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

優選地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針NDRG4-2Pb的使用濃度均為50～ 500μM。

更優選地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針NDRG4-2Pb的使用濃度均為100μ M。

進一步優選地，上述檢測試劑盒還包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探針 NDRG4-2Pb進行PCR擴增時，PCR擴增體系試劑，包括dNTP、鎂離子、反應緩沖液(buffer)、酶、 無核酸酶的水。

優選地，所述體系試劑包括5～20mM的dNTP、10～40mM的鎂離子、1×～10×反應緩 沖液、酶、無核酸酶的水。

更優選地，所述體系試劑包括5～15mM的dNTP、15～35mM的鎂離子、1×～10×反應 緩沖液、酶、無核酸酶的水。

最優選地，所述體系試劑包括10mM的dNTP、25mM的鎂離子、5×反應緩沖液(5× buffer)、酶、無核酸酶的水。

優選地，利用上述試劑盒進行NDRG4基因甲基化檢測時，PCR體系中各組分的反應 終濃度如下：

更優選地，利用上述試劑盒進行NDRG4基因甲基化檢測時，PCR體系按照如下比例 進行：