[發(fā)明專利]冬油菜葉片質(zhì)外體抗凍蛋白標樣制備方法及蛋白裂解液

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610047368.2
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105628471A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 孫萬倉;劉林波;楊剛;劉自剛;武軍艷;李學才;方彥;袁金海;侯獻飛;王凱音;馬驪;錢武;劉海卿;陳奇;張樹娟
• 申請（專利權）人: 甘肅農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 甘肅省知識產(chǎn)權事務中心 62100
• 代理人: 周立新

技術領域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學技術領域，涉及一種冬油菜葉片質(zhì)外體抗凍蛋白標樣制備方法；本發(fā)明還涉及一種該制備方法所用的蛋白裂解液。

背景技術

近年來，隨著我國冬油菜北移和北方冬油菜新產(chǎn)區(qū)的逐步形成，白菜型冬油菜成為了北方地區(qū)重要的油料作物和生態(tài)作物，同時也是促進北方耕作制度改革的先驅(qū)作物（孫萬倉,馬衛(wèi)國,雷建民,等.冬油菜在西北旱寒區(qū)的適應性和北移的可行性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2007,40(12):2716-2726）。由于我國北方地區(qū)冬季旱寒等嚴酷的氣候，嚴重影響冬油菜的生長發(fā)育，使得抗寒性一般的冬油菜越冬困難，因此研究冬油菜的抗寒性具有重要意義。徐呈祥等對豐富多樣的低溫誘導蛋白質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)其中的抗凍蛋白在植物抗寒冷機制中有著十分重要的作用（提高植物抗寒性的機理研究進展[J].生態(tài)學報,2012,32(24):7966-7980.）?？箖龅鞍祝ˋntifreezeProtein，AFP）是一類可以吸附到冰晶表面抑制冰晶生長速度、修飾冰晶形態(tài)、降低溶液冰點、抑制冰晶重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，對研究植物抗寒有重大意義。Griffith等在1992年第一次明確提出獲得植物內(nèi)生的抗凍蛋白，他們從經(jīng)低溫鍛煉能夠忍受細胞外結(jié)冰的冬黑麥中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源產(chǎn)生的AFP，并從冬黑麥葉片的質(zhì)外體中提取并部分純化了該蛋白；1994年費云標等從常綠抗凍植物沙冬青葉片中分離得到了抗凍蛋白；Meyer等在1999年發(fā)現(xiàn)胡蘿卜AFP基因在非低溫脅迫下不表達，在低溫脅迫下表達水平迅速提高。

SDS-PAGE（十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺）凝膠電泳是分析生物體蛋白質(zhì)常用的方法，其技術多采用Laemmli（1970）分析細菌蛋白的方法，該方法通過利用蛋白質(zhì)具有分子量大小不同的特性分離不同的蛋白質(zhì)，分離效果顯著。之后隨著二維電泳的逐漸發(fā)展，雙向電泳成為了蛋白質(zhì)組研究領域中的關鍵技術之一。但無論是SDS-PAGE凝膠電泳還是雙向電泳，樣品的制備都是其中關鍵的一步，在樣品制備過程中應遵循三個基本原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，減少蛋白質(zhì)的損失；2）減少對蛋白質(zhì)的人為修飾；3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。由于提取的植物材料不同，使用的蛋白裂解緩沖液也各不相同，需要通過不同試劑的合理組合，才能達到對樣品蛋白的最大提取。在提取過程中通過使用一些輔助增溶藥劑來提高蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白和疏水蛋白，其中尿素是較理想的中性增溶劑，它能很好地提高蛋白質(zhì)的溶解度，9mol/L以上的尿素適用于水稻葉片蛋白質(zhì)的提取；硫脲是另一種增溶劑，在膜蛋白的提取中應用較多(Pasquali等1997)，但由于它不溶于水、溶于高濃度尿素的特性，需與尿素混合使用，硫脲使用濃度為2mol/L；去垢劑也可有效地增加大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解性，早期常用TritonX-100和NP-40等非離子去垢劑，近幾年改用CHAPS等新型兩性離子去垢劑；還原劑最常用的是二硫蘇糖醇（DTT）。專利《冬油菜根質(zhì)外體抗凍蛋白的提取方法》（專利號CN201310313597.0，公告號CN103333234A，公告日2013.10.2）中公開的含β-巰基乙醇的蛋白裂解液在植物蛋白提取中應用廣泛，但β-巰基乙醇是劇毒物質(zhì)，對人體危害極大，并且該裂解液對質(zhì)外體抗凍蛋白樣品的裂解不夠充分，使得蛋白質(zhì)的損失較大；專利《一種蛋白標樣的制備方法及蛋白裂解液》（專利號ZL201010197856.4，公告號CN101865796B，公告日2011.12.21）中公開了將標準蛋白樣品溶于含尿素的蛋白裂解液中，得到蛋白質(zhì)標樣的方法，在該蛋白質(zhì)標樣制備過程中使用含7～9M尿素的蛋白裂解液。但是上述專利中的蛋白裂解液不適用于冬油菜質(zhì)外體抗凍蛋白的裂解，獲得的蛋白質(zhì)含量較低，且蛋白圖譜不清晰。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種冬油菜葉片質(zhì)外體抗凍蛋白標樣制備方法，能獲得較高含量的蛋白質(zhì)，檢測到的蛋白條帶數(shù)多而清晰。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述制備方法中所用的蛋白裂解液。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種冬油菜葉片質(zhì)外體抗凍蛋白標樣制備方法，將冬油菜葉片質(zhì)外體抗凍蛋白干粉溶于含尿素的蛋白裂解液中保存，即得冬油菜葉片質(zhì)外體抗凍蛋白標樣；

所述的冬油菜葉片質(zhì)外體抗凍蛋白干粉是用質(zhì)外體抗凍蛋白提取法從強冬性白菜型冬油菜油菜隴油7號和強冬性甘藍型冬油菜Vision中提取的。

本發(fā)明所采用的另一個技術方案是：一種上述制備方法中使用的蛋白裂解液，該蛋白裂解液中含有尿素，且尿素的摩爾體積濃度為6～10mol/L。