[發明專利]一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構建方法

有效

• 申請號: 201610046663.6
• 申請日: 2016-01-16
• 公開（公告）號: CN105505806B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 周晨妍;劉振華;王燕;王擁濤;李同彪;朱新術
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構建方法，首先利用生物信息學比對木聚糖酶XynZF?2基因序列與耐熱木聚糖酶EvXyn11基因序列的同源性，通過N?端替換將XynZF?2的N?端48個氨基酸替換成木聚糖酶EvXyn11N?端的34個氨基酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F，進而在XynZF?2酶C端繼續引入二硫鍵Cys38?Cys191、α?螺旋及cord區域分別引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A，最后引入糖基化修飾位點E42N和F17S，構建多位點突變雜合酶XynZL，期望雜合酶XynZL的熱穩定性有所改善。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構建方法。

背景技術

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是催化水解木聚糖的一類多功能酶的總稱。木聚糖酶廣泛分布于自然界中，如動物、植物和微生物等，且種類繁多，應用領域廣泛。目前，微生物來源的木聚糖酶研究報道很多，研究得最多的是來源于細菌和真菌的木聚糖酶。其中，細菌可以產生堿性和酸性木聚糖酶，而真菌可以產生堿性木聚糖酶。目前，木聚糖酶主要由真菌和細菌等微生物發酵生產而來。

隨著生物技術的不斷發展，木聚糖酶的研究開發備受關注。在工業應用方面，木聚糖酶具有很大的工業應用潛力和價值，它是一種重要的工業酶制劑，廣泛應用于食品加工、釀造、紙漿漂白、制藥、飼料添加劑、醫藥、紡織、生物轉化等領域。木聚糖酶在使用過程中對外界物化條件極為敏感，在工業進程中的高溫、重金屬離子、氧化劑和極端pH等條件下，都會使木聚糖酶構象遭到破壞，從而限制了酶的應用環境。因此，提高木聚糖酶穩定性已成為研究者廣泛關注的焦點。目前，通過生物信息學分析比對木聚糖酶晶體結構發現，氫鍵、離子鍵數目、鹽橋、N端以及α-螺旋處區域等與木聚糖酶的穩定性密切相關。很多人以此為依據，通過基因工程和酶工程等手段研究木聚糖酶的穩定性，并取得了良好的成果。

目前已經發現影響木聚糖酶熱穩定性的諸多因素，但國內外對于木聚糖酶分子熱穩定性突變位點的報道相對較少。一般來說所有的二硫鍵在蛋白質折疊和穩定性方面都起著關鍵的作用，且與蛋白質的熱穩定性密切相關。N端二硫鍵的引入對酶熱穩定性的影響國內外已有報道，但C端引入二硫鍵對木聚糖酶熱穩定性有無影響，未見報道。

隨著蛋白質組學技術不斷發展，人們發現蛋白質糖基化對蛋白質構象的穩定有一定的作用。糖基化是在酶的控制下，蛋白質或脂質附加上糖類的過程，發生于內質網。在糖基轉移酶作用下將糖轉移至蛋白質，和蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵。目前，對于蛋白質糖基化修飾研究主要是N-糖基化和O-糖基化。研究發現，N-糖基化多發生在Asn-Xaa-Ser/Thr序列的Asn殘基上，O-糖基化多發生β-轉角區域。另外，通過糖基化修飾來提高木聚糖酶穩定性的研究相對較少，因此，有一定的探索空間。

發明內容

為了克服現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構建方法，首先利用生物信息學比對木聚糖酶XynZF-2基因序列(GenBank AccessionNo.JQ700382)與耐熱木聚糖酶EvXyn11基因序列(GenBank AccessionNo.EU591347)的同源性，通過N-端替換將XynZF-2的N-端48個氨基酸替換成木聚糖酶EvXyn11N-端的34個氨基酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F，進而在XynZF-2酶C端繼續引入二硫鍵Cys38-Cys191、α-螺旋及cord區域分別引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A，最后引入糖基化修飾位點E42N和F17S，構建多位點突變雜合酶XynZL，期望雜合酶XynZL的熱穩定性有所改善。

其技術方案如下：

一種木聚糖酶雜合酶工程菌株的構建方法，包括以下步驟：

步驟1、木聚糖酶結構分析