[發明專利]一種沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA及其應用

有效

• 申請號: 201610046163.2
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105483131A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 張祎;韓日疇
• 申請（專利權）人: 廣東省昆蟲研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01N57/16;A01P7/02
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于生物化學與分子生物學領域，具體涉及一種沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因 VTP的dsRNA及其應用。

背景技術：

狄斯瓦螨Varroadestructor(Anderson&Trueman,2000)是危害世界養蜂業的重要外寄 生蟲，給世界養蜂業及農業帶來巨大損失(Martinetal.,2004)。狄斯瓦螨可危害蜜蜂封蓋幼 蟲、蛹和成蜂，同時攜帶并傳播蜜蜂病毒，與梅氏熱厲螨(Tropilaelapsmercedesae)共感染 (Luoetal.,2011)，從而造成蜂群生產力嚴重下降，乃至全群毀滅。狄斯瓦螨以蜜蜂的血淋 巴為食，成年雌螨在蜂蛹的表皮上打孔喂養它的子代，其唾液蛋白能夠抑制血細胞凝集，阻 止蜜蜂的傷口愈合并減少相應的宿主反應(Richardsetal.,2011)。

本實驗室從狄斯瓦螨唾液中分離純化到一個對蜜蜂具有毒性的狄斯瓦螨唾液毒性蛋白 VTP，及其編碼基因-狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種對狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因具有非常好的沉默效果的 dsRNA。

本發明的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA，其特征在于，由SEQIDNO.1 所示的核苷酸序列和其反向互補序列所示的核苷酸序列組成的雙鏈RNA。

本發明的第二個目的是提供上述dsRNA在沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP中的應 用。

一種沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的制劑，其特征在于，含有上述dsRNA作為 有效成份。

本發明的第三個目的是提供上述dsRNA在狄斯瓦螨感染蜜蜂情況下提高蜜蜂存活率中 的應用。

一種防控蜜蜂受狄斯瓦螨感染下提高蜜蜂存活率的制劑，其特征在于，含有上述dsRNA 作為有效成份。

本發明通過實驗發現，本發明的沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的dsRNA能夠沉 默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP，與對照相比浸泡在沉默狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP 的dsRNA中的狄斯瓦螨，其體內狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的mRNA含量顯著降低， 并持續到蜜蜂預蛹羽化，沉默了狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP后的狄斯瓦螨毒性顯著降低， 與對照相比，其侵染后意蜂的預蛹存活率明顯提高，而中華蜜蜂預蛹的死亡率也顯著降低。 因此可以將本發明的dsRNA沉默狄斯瓦螨的毒性蛋白基因，從而達到降低狄斯瓦螨對蜜蜂的 危害。

附圖說明：

圖1是沉默效果測定圖，其中Vd-CK代表狄斯瓦螨沒有經過任何處理；Vd-0.9％NaCl代表 狄斯瓦螨浸泡過質量分數0.9％NaCl溶液；Vd-dsGFP代表狄斯瓦螨浸泡過dsRNA-GFP； Vd-dsVTP表示蜜蜂被浸泡過dsRNA-VTP溶液的狄斯瓦螨侵染。

圖2是沉默后狄斯瓦螨對蜜蜂的毒性檢測圖，圖A是對意大利蜜蜂預蛹的測定，圖B是對中 華蜜蜂預蛹的毒性測定，圖中dsVTP表示狄斯瓦螨浸泡過dsRNA-VTP；dsGFP表示狄斯瓦螨 浸泡過dsRNA-GFP；0.9％NaCl表示狄斯瓦螨浸泡過質量分數0.9％NaCl溶液；Vd表示狄斯 瓦螨沒有經過任何處理；NoVd：蜜蜂預蛹中沒有加入瓦螨侵染的空白對照。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

1.狄斯瓦螨和蜜蜂的收集：狄斯瓦螨成年雌螨收集于意蜂工蜂房內，取出后放在內置9cm 濾紙的無菌培養皿中，備用。蜜蜂預蛹則置于墊有無菌濾紙的48孔培養板，每孔放1只 預蛹，備用。

2.狄斯瓦螨唾液毒性蛋白基因VTP的克隆

取狄斯瓦螨約60頭，采用TriZolReagent(Invitrogen公司，其貨號為：15596026)提取總 RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的純度及量，取1μg的總RNA做 起始逆轉錄反應，采用的逆轉錄試劑盒為SMARTer^TMRACEcDNAAmplificationKit(Clontech, 貨號：634923)，逆轉錄反應的步驟參考該試劑盒的使用說明，獲得逆轉錄產物。

以逆轉錄產物為模板，設計VTP基因的特異性引物：