[發明專利]一種利用熒光輔助糖電泳對玉米芯木聚糖酶解產物分析鑒定不同木聚糖酶功能的方法

在審

• 申請號: 201610045533.0
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105603046A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 王祿山;公維麗;張懷強;吳秀蕓;張群
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明屬于熒光輔助糖電泳技術領域，具體涉及一種利用熒光輔助糖電泳對玉米芯木聚 糖酶解產物分析檢測不同木聚糖酶功能的方法。

背景技術

在木質纖維素中木聚糖是繼纖維素之后最為豐富的植物細胞壁多糖，但是木聚糖的結構 組成卻明顯復雜于纖維素。木聚糖骨架是由木糖殘基通過β-1,4糖苷鍵連接而成，并被L-阿 拉伯糖、葡萄糖醛酸及4-O-甲基葡萄糖醛酸等側鏈糖基取代。由于木聚糖結構組成復雜，導 致對其降解利用需要復雜的酶系。降解木聚糖骨架的酶主要包括1,4-β-D-木聚糖酶、β-木糖 苷酶，側鏈的去除主要由L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶等完成。在木聚糖降解酶 系中，1,4-β-D-木聚糖酶在將木聚糖降解為木寡糖中發揮著重要的作用，降解產生的木寡糖 可以在β-木糖苷酶的作用下完全轉化成木糖。木寡糖已于2008年被中國衛生部批準為新功 能性食品(2008，衛生部)，它具有高效、穩定、安全、無毒等優點，因此越來越多地被用 于食品、飼料、醫藥等領域。而木糖在生物燃料的生產中具有重要應用價值。1,4-β-D-木聚 糖酶的功能差異及與β-木糖苷酶的比例決定著木寡糖的種類及木糖的產量。農業廢棄物玉 米芯中含有豐富的可利用木聚糖，通過不同酶系的作用可以產生不同種類價值的產品，因此， 快速確定不同木聚糖酶的功能差異及酶系中酶與酶之間的協同對復配特定的降解酶系用于 不同的生產需求具有重要意義。

木聚糖酶的功能差異主要通過酶解產物反映，目前，對于木聚糖的復雜酶解產物，特別 是低聚木糖尚缺乏快速、靈敏和可定量的分析方法。常用的方法有薄層層析(TLC)技術、 高效液相色譜(HPLC)法等。TLC檢測過程中容易使復雜樣品擴散、拖尾從而影響分離和 定量結果，而HPLC對糖的檢測靈敏度不高，尤其是對木寡糖的分離效果不佳。熒光輔助糖 電泳(FACE)使用熒光基團標記單糖、寡糖和多糖還原端，8-萘胺-1,3,6-三磺酸(ANTS) 和7-萘胺-1,6-二磺酸(ANDS)經常用作熒光標記物，其氨基基團可以與糖環呈打開狀態的 單糖或寡糖形成席夫堿，再經過一種合適的還原劑(NaCNBH₃)還原，使熒光標記物的耦 合變為不可逆反應，使木聚糖酶解產物可以在凝膠上得以有效的分離，并通過靈敏的熒光成 像系統進行鑒定分析。但檢索發現有關利用熒光輔助糖電泳對玉米芯木聚糖酶解產物分析鑒 定不同木聚糖酶功能的方法還未見報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種利用熒光輔助糖電泳對玉米芯木 聚糖酶解產物分析鑒定不同木聚糖酶功能的方法。

本發明所述利用熒光輔助糖電泳對玉米芯木聚糖酶解產物分析鑒定不同木聚糖酶功能 的方法，步驟是：

(1)利用玉米芯制備粒徑均一超細的玉米芯木聚糖粉，獲得玉米芯木聚糖；

(2)用不同待鑒定木聚糖酶對玉米芯木聚糖實施酶解；

(3)利用熒光輔助糖電泳對玉米芯木聚糖酶解產物分析；

(4)根據對玉米芯木聚糖酶解產物分析結果判定待鑒定木聚糖酶功能的差異；

其特征在于：

步驟(1)所述利用玉米芯制備粒徑均一超細的玉米芯木聚糖粉的方法是：

①將烘干后的玉米芯粉碎成粒徑為0.2±0.1mm的顆粒，過80目篩子，獲得粒徑均一 的玉米芯粉；

②將制得的粒徑均一的玉米芯粉按質量體積比1:8-9的比例加入蒸餾水，于105±2℃ 預處理40-50min，然后用8層紗布過濾，收集濾渣；

③將濾渣烘干后研磨1-2h；

④研磨后加入與①所述蒸餾水體積相同量的濃度為15％(w/v)的氫氧化鈉溶液，于 115±2℃下蒸煮40-50min,然后用8層紗布過濾，收集濾液；

⑤濾液用濃度為30％(w/v)的氫氧化鈉溶液對其進行脫色處理0.5-1h；

⑥脫色處理后的溶液用濃度為15％(w/v)的三氯乙酸溶液脫蛋白，其中所述溶液與 三氯乙酸溶液的體積比為8:1；

⑦將脫蛋白后的溶液以8000r/min離心30min，收集上清液，然后加入濃鹽酸將該溶 液的pH調至6.0；

⑧加入⑦制得的溶液3倍體積量的無水乙醇，醇沉12-20h，然后8000r/min離心20 min，收集的沉淀物即為木聚糖粗提物；