[發(fā)明專利]一種褐藻膠裂解酶、其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610043881.4
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN106995811B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱玥明;陳朋;曾艷;門燕;孫媛霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12P19/00;A23L29/00;A61K8/66;A61Q19/00;C12R1/19;C12R1/125;C12R1/85
• 代理公司: 11332 北京品源專利代理有限公司
• 代理人: 鞏克棟;侯瀟瀟<國際申請>=<國際公布>

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種褐藻膠裂解酶、其制備方法及應(yīng)用，所述褐藻裂解酶的成熟蛋白包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其前體蛋白包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。所述褐藻裂解酶性質(zhì)穩(wěn)定，比酶活高達(dá)4600U/mL以上，可將褐藻膠酶解為具有特殊生物學(xué)活性的小分子褐藻寡糖，具備工業(yè)應(yīng)用的潛質(zhì)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種褐藻膠裂解酶、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-1,4-mannuronic acid，簡稱M)和其5位差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸(α-L-1,4-guluronicacid，簡稱G)以C-1,4糖苷鍵非均聚形成的線性分子。，分子內(nèi)聚M段、聚G段和M/G混合段交替排列。通常，褐藻膠由海帶、馬尾藻等食用型褐藻加工制得。銅綠假單胞菌、棕色固氮菌等微生物能分泌具有乙酰基修飾的褐藻膠。

研究發(fā)現(xiàn)褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻寡糖具有抗腫瘤、抗凝血、增強(qiáng)植物抗逆性、促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌生長等眾多生理活性，其功能評價和開發(fā)研究得到不斷深入，活性及藥用價值研究已經(jīng)成為新的熱點。最新研究表明：用褐藻膠制備的聚M段寡糖藥物“971”能抑制β淀粉樣細(xì)胞的聚集和細(xì)胞毒性，正用于抗阿爾茲海默癥的二期臨床研究；聚G寡糖可與抗生素協(xié)同抑制臨床多耐藥致病菌。因此，組成特殊、聚合度特定的褐藻膠寡糖具有重要應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值，實現(xiàn)這類寡糖的高效制備具有重要意義。

褐藻寡糖有多種方法制備，如酸降解法、氧化降解法、超聲降解法和酶降解法等。褐藻膠裂解酶作為工具酶酶解生產(chǎn)褐藻寡糖和低分子量多糖具有降解條件溫和，過程可控，得率高等優(yōu)點，已逐漸取代傳統(tǒng)的酸解方法而成為褐藻寡糖生產(chǎn)的主要方式。此外，褐藻膠裂解酶可以作為工具酶用于褐藻膠精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析，海藻單細(xì)胞及原生質(zhì)體的制備，治療囊性纖維化(CF)患者的肺部感染及生產(chǎn)生物燃料等。褐藻膠裂解酶通過β-消除反應(yīng)催化降解褐藻膠單體間的1,4糖苷鍵，在C4，C5之間形成不飽和雙鍵，并伴隨4-O-糖苷鍵的消除，且在還原端生成4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyl uronic acid。褐藻膠裂解酶按其降解褐藻多糖作用方式的不同在EC數(shù)據(jù)庫中被分為多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和α-L-1，4-古洛糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)。

CN 102994407 A公開了一種內(nèi)切褐藻膠裂解酶Alg2A的基因序列及其制備方法與應(yīng)用。該發(fā)明所涉及的褐藻膠裂解酶Alg2A來源土壤新分離菌株Flavobacterium sp.S20。該發(fā)明還提供了一種制備該新型褐藻膠裂解酶的方法，即利用基因工程的技術(shù)方法，將該新褐藻膠裂解酶的基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體上，獲得可異源表達(dá)該酶的大腸桿菌重組菌株，用該菌株異源表達(dá)制備的褐藻膠裂解酶Alg2A，具有降解褐藻酸鈉制備褐藻酸鈉寡糖的功能。CN 104293754 A公開了一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用，內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5，所述的褐藻膠裂解酶AlgL-5降解褐藻膠過程中寡糖主產(chǎn)物包括不飽和二糖、不飽和三糖、和不飽和四糖不飽和五糖。酶的最小不飽和寡糖底物是五糖，最小不飽和寡糖產(chǎn)物是二糖。但是這兩種酶的活性不夠高，底物專一性差，無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

在自然界中能夠產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的生物分布廣泛，已報到產(chǎn)褐藻膠裂解酶的物種有海洋軟體動物、棘皮動物、細(xì)菌、真菌等,其中對細(xì)菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶的研究最多。目前褐藻膠裂解酶的產(chǎn)品開發(fā)依然面臨不安全、酶活力較低、酶穩(wěn)定性差、酶的底物譜窄等問題。因此，篩選酶活力高、酶活穩(wěn)定、產(chǎn)酶量高的褐藻膠裂解酶具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足及實際的需求，本發(fā)明提供一種褐藻膠裂解酶、其制備方法及應(yīng)用，所述褐藻膠裂解酶活性好，底物專一性好。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種褐藻裂解酶，所述褐藻裂解酶包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。