[發(fā)明專利]一種檢測結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610043861.7
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN106996928A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊柳;張躍建
• 申請（專利權(quán)）人: 上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司31213
• 代理人: 王巍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)，尤其涉及一種檢測結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

結(jié)核病是全球三大傳染性疾病之一，中國結(jié)核患者數(shù)量居全球第二位，全國結(jié)核感染率為44.5％，平均每年新發(fā)病例91.2萬，死亡4.7萬人。結(jié)核病給人們帶來了很大的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。隨著研究的不斷深入，結(jié)核病的臨床診斷方法取得了較大的發(fā)展，免疫學(xué)檢測方法是現(xiàn)階段檢測結(jié)核分枝桿菌感染的重要輔助方法之一，其中以抗原特異性刺激后的γ干擾素釋放實驗(IGRA)為主。IGRA方法通常采用結(jié)核分枝桿菌特異性的RD(Region of Difference)區(qū)基因編碼抗原，因而較好的避免已接種BCG(卡介苗)的干擾。然而，現(xiàn)有報道表明人群存在較嚴(yán)重的非結(jié)核分枝桿菌感染情況，現(xiàn)有商用試劑盒T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-IT在結(jié)核病診斷應(yīng)用中的效果不甚理想，表現(xiàn)為其檢測的敏感性均為80％左右。其中主要原因是檢測方法分別是ELISPOT和ELISA法，方法的靈敏度均有限，在診斷的特異性和敏感性方面還存在一些不足，需要加以改進(jìn)?，F(xiàn)有研究表明，酶促化學(xué)發(fā)光法通過酶和發(fā)光底物的放大途徑，可達(dá)到數(shù)十倍至數(shù)百 倍于ELISA法的靈敏度。目前尚未見有磁珠化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)核感染試劑盒的報道，宜進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，克服上述不足之處，研究設(shè)計利用化學(xué)發(fā)光與酶聯(lián)免疫分析相結(jié)合，具有更高靈敏度的檢測結(jié)核感染試劑盒。

本發(fā)明所述試劑盒

本發(fā)明提供了一種檢測結(jié)核感染的磁珠化學(xué)發(fā)光試劑盒，所述試劑盒包括：鏈霉親合素磁珠混懸液、γ干擾素校準(zhǔn)品、植物凝集素(PHA)、結(jié)核桿菌特異性抗原多肽、無血清培養(yǎng)液(AIM-V)、生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗、發(fā)光底物液(APS 5)、校準(zhǔn)品稀釋液、抗體稀釋液和洗滌液。

具體的，本發(fā)明所述試劑盒由下列組分各一份組成：

(1)鏈霉親合素磁珠混懸液，10ml/支；

(2)γ干擾素校準(zhǔn)品，1μg/瓶；

(3)PHA植物凝集素，10ml/瓶；

(4)結(jié)核桿菌特異性抗原多肽,10ml/瓶；

(5)無血清細(xì)胞培養(yǎng)液(AIM-V),10ml/瓶；

(6)生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，0.5ml/管；

(7)堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，0.5ml/管；

(8)發(fā)光底物液(APS 5)，25ml/瓶；

(9)校準(zhǔn)品稀釋液,10ml/瓶；

(10)抗體稀釋液，10ml/瓶；

(11)洗滌液，20ml/瓶。

本發(fā)明試劑盒所述的鏈霉親合素磁珠混懸液作為酶聯(lián)免疫和固相分離載體，用于捕獲抗原-抗體復(fù)合物；濃度為0.1mg/ml。

所述的γ干擾素校準(zhǔn)品為白色凍干粉，濃度為1μg/ml。

所述的PHA植物凝集素作為陽性對照，濃度為100-200μg/ml。

所述的結(jié)核桿菌特異性抗原多肽，特異性刺激樣本分泌γ干擾素，濃度為5-20μg/ml。

所述多肽是一種氨基酸聚合物

所述的無血清培養(yǎng)液(AIM-V)作為空白對照。

所述的二種抗人γ干擾素單抗分別為生物素標(biāo)記單抗和堿性磷酸酶標(biāo)記單抗，這兩種單抗與抗原反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物。

本發(fā)明試劑盒所述生物素標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗，稀釋比為1:2000；堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人γ干擾素單抗,稀釋比為1:200。

所述抗原可以天然分離得到，也可以通過克隆技術(shù)和基因工程的方法獲得融合蛋白，此為行業(yè)內(nèi)所熟悉的公知技術(shù)。

本發(fā)明試劑盒所述的發(fā)光底物液APS 5為堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物。

所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液含1％牛血清白蛋白，0.01M PH7.4的磷酸鹽緩沖液及0.02％Procline-300。

所述抗體稀釋液含1％牛血清白蛋白，0.01M PH7.4的磷酸鹽緩沖液,1M NaCl及0.02％Procline-300。

所述洗滌液為三羥甲基氨基甲烷洗滌液pH值為7.4,含0.8gNaCl,0.02gKCL,0.3g Tris堿及0.05％吐溫-20。

本發(fā)明試劑盒使用不透明白色酶標(biāo)板進(jìn)行檢測。

所述的不透明白色酶標(biāo)板為96孔可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶標(biāo)板。