[發明專利]一種重組華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白及其體外可溶性表達與純化制備方法

有效

• 申請號: 201610041846.9
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105601749B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 李學榮;吳銀娟;余新炳
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/18;C12N15/70
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 郭婧婧;許亦琳

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白及其體外可溶性表達與純化制備方法。現有表達技術獲得的CssPLA2蛋白是包涵體，沒有酶活性，即使包涵體復性后酶活性也非常微弱。本發明所述重組CssPLA2蛋白，含有CssPLA2蛋白和MBP標簽蛋白。本發明通過廣泛而深入的研究，通過特殊表達方式的優化，首次實現了CssPLA2蛋白的可溶性表達，并制備獲得了具有生物活性的重組CssPLA2蛋白，有效地克服了現有表達技術中所存在的問題。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白及其體外可溶性表達與純化制備方法。

背景技術

現有針對華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白(亦即，CssPLA2蛋白，GenBank登錄號：ABL07371.1)的表達技術只能以包涵體形式表達出無生物活性的華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白，由于所表達出的華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白不具有生物活性，而不能用于進行該蛋白的功能研究。即使進行復雜的蛋白復性技術處理后，所得蛋白的生物性活性仍然相當低。

例如：現有文獻F.Hu et al./Molecular&Biochemical Parasitology 167(2009)127–134以華支睪吸蟲cDNA文庫編號為Cs4e05的質粒為模板，應用設計的特異引物，進行PCR擴增目的基因。將目的基因和原核表達質粒pET-28a酶切、回收、連接及轉化，構建重組質粒pET-28a-CssPLA2.將構建的重組質粒轉化入BL21(DE3)感受態細胞，將CssPLA2重組工程菌液大量培養、IPTG誘導表達后，重組蛋白以包涵體形式表達，12％SDS-PAGE電泳顯示在分子量約34kDa處出現一明顯條帶。由于重組蛋白以包涵體形式表達，破菌得到的包涵體經6M尿素變性、稀釋和透析復性后，經過金屬離子親和層析柱，在不同低濃度咪唑梯度漂洗后，用200mmol/L咪唑洗脫，獲得分子量約34kDa的單一蛋白。MTT法和流式細胞儀檢測了CssPLA2蛋白刺激人肝星狀細胞LX-2增殖，半定量RT-PCR檢測了CssPLA2蛋白可促進人肝星狀細胞LX-2Ⅲ型膠原的mRNA表達上調，從而導致肝纖維化。

至今，現有技術中尚未見能夠實現華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白可溶性表達的技術。

發明內容

為了克服現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種重組華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白(亦即，重組CssPLA2蛋白)及其體外可溶性表達與純化制備方法。

為了實現上述目的以及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種重組CssPLA2蛋白，含有CssPLA2蛋白和MBP標簽蛋白。

優選地，所述CssPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具體為：KPRSISRDKPHAELEWSGKLSDNQTIHIWTVASKGLFGEISKPAWIQVDIRGSNSSQDAIRLIFDQEHRLRYCVFGTDTVETSVSLDDADLLTRNPIYLEHFFFTSANEFLRACKELRRASEEPAKLVRRPRTAYRANPMIMPGTLWCGKGNAATRERTFGDEIETDMCCRTHDRCFENIQSLTSKFGYYNPSPVTISNCECDDEFLSCLENAGTEAATRVGNLYFNVFKIPCFLRRTERICTHNDESGACGQFENREDIELFRPQRFVAPYITV。

優選地，所述MBP標簽蛋白的氨基酸序列為pMAL-c2X質粒上MBP標簽蛋白編碼序列所對應的氨基酸序列。

優選地，CssPLA2蛋白的N端與MBP標簽蛋白的C端連接。