[發明專利]一種檢測CYP19A1基因多態性的引物及其方法

在審

• 申請號: 201610041600.1
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105525001A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 胡昌明;梁耀銘;于世輝;趙薇薇;燕啟江;羅錦霞
• 申請（專利權）人: 廣州金域檢測科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測CYP19A1基因多態性的引物及 其方法。

背景技術

多藥耐藥基因(MDR1)編碼P-糖蛋白（P-gp），它是人體藥物轉運中最重要的轉運 體，能主動將疏水性抗腫瘤藥物泵出胞外，從而減少細胞內藥物濃度。幾乎所有的腫瘤，包 括各種實體瘤、白血病、淋巴瘤等均有MDR1表達。

芳香化酶是細胞色素P450酶超家族成員，編碼基因為CYP19A1，可催化睪酮、雄烯 二酮向雌酮、雌二醇轉化，在雌激素生物合成中起最終的限速催化作用。芳香化酶抑制劑 （AIs）通過抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，從而消除雌激素對腫瘤生長的刺激作用。絕 經后婦女的雌激素主要來源于雄激素前體物質在外周組織的芳香化，故該類藥物主要用于 自然絕經或人工絕經后的乳腺癌患者。阿那曲唑、來曲唑（第三代非甾體類AIs）對芳香化酶 的抑制程度可達99％以上。

臨床研究證實，CYP19A1基因多態性對芳香化酶抑制劑在乳腺癌的治療效果有著 很大的影響作用。在接受來曲唑治療的絕經后激素受體陽性轉移性乳腺癌患者，攜帶 CYP19A1基因rs4646G＞T突變患者的的疾病進展時間比正常者明顯延長。因此，CYP19A1 3’-UTRrs4646G＞T是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制劑治療療效的有效預測指標。

因此，檢測CYP19A1基因的多態性，可以有效的預測絕經期晚期乳腺癌患者接受芳 香化酶抑制劑的治療療效；同時還可以預測多種抗腫瘤藥物與免疫抑制劑療效及不良反應 風險，具有重要的臨床價值。

中國專利CN101781684B公開了CYP19A1基因SNP檢測液相芯片及檢測方法，所述液 相芯片包括有針對CYP19A1基因的SNP位點分別設計的野生型和突變型特異性ASPE引物，每 種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的針對目的基因SNP位點的特異性引物序列組成。該檢 測方法檢測特異性好，可以實現多個SNP位點的并行檢測。但是，上述檢測操作繁瑣，不利于 大規模的推廣和應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測CYP19A1基因多態性的引物及其方法，該引物主 要用于檢測CYP19A1基因c.*161T>G(SNP:rs4646)位點，具有特異性好、靈敏度高、準確性好 等優點，為CYP19A1基因多態性提供了一種簡單有效的檢測方法。

本發明提供了一種檢測CYP19A1基因多態性的引物，包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴增引物為：針對CYP19A1_rs4646的上游引物5’- TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3’（SEQIDNO.1）和下游引物5’-TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3’ （SEQIDNO.2）；所述SNaPshotPCR引物為：針對CYP19A1_rs4646的SNaPshotPCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTCTATGGGTTGTCACCAAGCTAGGTGCTATT-3’（SEQIDNO.3）。

另外，本發明提供一種檢測CYP19A1基因多態性的方法，包括如下步驟：

S1提取DNA樣品；

S2以步驟S1提取的DNA樣本為模板，采用權利要求1中所述的PCR擴增引物進行多重PCR 擴增，并對擴增產物進行純化；

S3以步驟S2純化后的PCR擴增產物為模板，采用權利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 進行SNaPshotPCR擴增，并對SNaPshotPCR擴增產物進行純化；

S4采用毛細管電泳技術進行檢測，對檢測結果進行分析，確定SNP位點及其基因型。

進一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。

進一步地，所述步驟S2中的多重PCR擴增反應條件包括：階段1：98℃3min；階段2： 98℃10s；階段3：58℃30s；階段4：72℃1min；階段5：返回到階段2，29個循環；階段6：72℃ 5min；階段7：25℃保溫。

進一步地，所述步驟S3中的SNaPshotPCR擴增反應條件包括：階段1：96℃10s；階 段2：55℃5s；階段3：60℃30s；階段4：返回到階段1，25個循環；階段5：4℃保溫。

進一步地，所述步驟S4中采用GENEMAPPERIDV4.1軟件對檢測結果進行分析。