[發(fā)明專利]一種神經(jīng)導(dǎo)管的制備工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610041486.2
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105412985B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 莊海;卜壽山;許金菊;張繼生;宋冬生
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省人民醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/50;A61L27/58
• 代理公司: 無錫萬里知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32263
• 代理人: 王傳林

1.一種神經(jīng)導(dǎo)管的制備工藝，其特征在于，依次包括載GDNF明膠微球的制備的制備工藝、明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠的合成工藝、聚己內(nèi)酯/明膠電紡神經(jīng)管的制備方法和電紡神經(jīng)管與載GDNF明膠微球的結(jié)合方法；

所述載GDNF明膠微球的制備的制備工藝具體包括如下步驟：

A1.配制質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10％的B型明膠水溶液，預(yù)熱至45℃?zhèn)溆茫?/p>

A2.將包含1％span80的液體石蠟于45℃水浴20min后，將上述10mL明膠水溶液緩慢滴入，在45℃水浴條件下磁力攪拌15min形成乳液；

A3.將所述步驟A2所得乳液通過冰浴使乳液迅速降溫至4℃，繼續(xù)磁力攪拌30min后，向上述乳液中加入預(yù)冷至4℃的丙酮，保持上述體系溫度低于4℃，繼續(xù)攪拌1h，即形成空白明膠微球一；

A4.將所述步驟A3所得空白明膠微球通過丙酮洗滌3次，乙醚洗滌2次，冷凍干燥24h，即可獲得干燥的空白明膠微球二；

A5.稱取空白明膠微球二與濃度為10-50mmol/L的EDC丙酮水溶液按空白明膠微球二與EDC的質(zhì)量比為125:12～60的比例進(jìn)行混合均勻，在4℃下磁力攪拌2h后在室溫下繼續(xù)攪拌8h，得交聯(lián)后的空白明膠微球三；

A6.所述步驟A5所得的交聯(lián)后的空白明膠微球三用超純水洗3次后，用20μm的濾器過濾獲得粒徑小于20μm的微球，冷凍干燥24h，得交聯(lián)后干燥且均勻的空白明膠微球四；

A7.將濃度為8μg/mL，pH值為7.0-7.5的GDNF溶液滴加入空白明膠微球四上，并按體積與質(zhì)量比為1uL/1mg的比例滴入，然后在4℃下孵育20h后冷凍干燥，即得載GDNF的空白明膠微球；

所述明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠的合成工藝具體包括如下步驟：

B1.將質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為15％的B型明膠水溶液于50℃水浴1h；

B2.向所述步驟B1所得水浴后質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為15％的B型明膠溶液中加入適量的甲基丙烯酸酐，獲得的溶液繼續(xù)在50℃下磁力攪拌1h；

B3.將步驟B2所得磁力攪拌后的溶液用截留分子量為12KDa的透析膜在雙蒸水中透析3天，且每8小時更換一次透析液，去除反應(yīng)副產(chǎn)物—甲基丙烯酸；

B4.將步驟B3所得透析后的溶液于-20℃～-40℃冷凍干燥1天，于-40℃保存?zhèn)溆茫?/p>

B5.所述步驟B4所得備用的材料在使用時要將凍干后的材料用水溶解為0.15g/mL的工作液；

所述聚己內(nèi)酯/明膠電紡神經(jīng)管的制備方法具體包括如下步驟：

C1.分別稱取一定量的聚己 內(nèi)酯和B型明膠，將聚己 內(nèi)酯和B型明膠分別溶于一定體積的三氟乙醇中；

C2.將完全溶解于三氟乙醇中的聚己 內(nèi)酯和B型明膠混合成均質(zhì)溶液；

C3.將步驟C2所得均質(zhì)溶液轉(zhuǎn)入接有注射泵的微量注射器內(nèi)，注射器的金屬注射針頭接有15-18KV的高壓電源正極，在對側(cè)，一個直徑為2cm的不銹鋼轉(zhuǎn)軸與電源的負(fù)極連接來收集納米電紡絲；

C4.調(diào)節(jié)注射針頭到轉(zhuǎn)軸的距離為14cm，注射泵的速度為1mL/h，轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)速為500-600rpm；

C5.開啟高壓電源，進(jìn)行電紡，電紡?fù)瓿珊髮⒅瞥傻木奂簝?nèi)酯/明膠電紡神經(jīng)管在一定時間后通過戊二醛蒸汽交聯(lián)1.5h，交聯(lián)后的電紡神經(jīng)管冷凍干燥24h后，儲存于-4℃冰箱備用；

所述電紡神經(jīng)管與載GDNF明膠微球的結(jié)合方法具體包括如下步驟：

D1.所述步驟A7所得的載GDNF的空白明膠微球、步驟B5所得的明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠溶解后的工作液、步驟C5所得交聯(lián)后的聚己內(nèi)酯/明膠電紡神經(jīng)管在紫外燈下消毒12h備用；

D2.將步驟B5所得的明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠溶解后的工作液在37℃下配置為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為15％濃度的水溶液備用；

D3.將步驟A7所得的載GDNF的空白明膠微球與所述步驟D2所得的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為15％濃度明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠溶液按質(zhì)量與體積比為1mg/11uL的比例混合均勻，制成含有載GDNF的空白明膠微球的明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠溶液；

D4.向所述步驟D3所得的含有載GDNF的空白明膠微球的明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠溶液中依次加入體積相同的濃度為600-1100mmol/L的過硫酸銨溶液和濃度為600-1100mmol/L四甲基乙二胺溶液，且過硫酸銨溶液與所述步驟D3中明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠溶液的體積比為1/22,然后將混合液迅速注入制備好的電紡神經(jīng)管中，在37℃中反應(yīng)20min，即可成膠并與電紡神經(jīng)管相結(jié)合，且在最終反應(yīng)體系中，APS和TEMED的摩爾濃度都為25-50mmol/L，全過程在無菌條件下完成，制成GelMA水凝膠混合載GDNF明膠微球結(jié)合的電紡神經(jīng)管，即最終的神經(jīng)導(dǎo)管。