[發明專利]一種人臍帶間質干細胞分離并誘導為軟骨細胞的培養方法

在審

• 申請號: 201610041210.4
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105524878A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 朱偉民;王大平;熊建義;崔家鳴;劉啟頌;陳潔琳;陳云芳;李興福
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 深圳市合道英聯專利事務所(普通合伙) 44309
• 代理人: 廉紅果

技術領域

本發明涉及間充質肝細胞技術領域，具體地，為一種人臍帶分離培養間質干細胞 并誘導為軟骨細胞的培養方法。

背景技術

關節軟骨損傷在臨床上較為常見，由于關節軟骨無血液供應和神經支配，自身修 復能力很差，關節軟骨一旦損傷即很難修復，如不及時治療，繼而會發生不可逆的病理變 化，造成關節的退行性改變(關節炎)，嚴重影響患者的生活質量，臨床癥狀主要表現為關節 活動后腫脹、疼痛，上下樓、下蹲困難。

間質干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞，間質干細胞存在于人體多種組織 中，尤其是臍帶、胎盤、骨髓、脂肪組織，這種干細胞在不同的誘導條件下可分化成許多不同 的組織，如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、內皮組織、肌肉組織、神經組織、上皮組織等，2002 年Wakitani等首次報道間質干細胞可定向到軟骨細胞用于治療軟骨損傷。

發明內容

本發明采用人臍帶間質干細胞(hUC-MSCs)其目的在于提供一種生長速度快、方法 簡單，費用低，生物安全性高的軟骨細胞培養方法。本發明是采用如下方案實現的：

一種人臍帶間質干細胞的分離培養方法，包括以下步驟，

(1)原代培養：取預處理過的人臍帶沃頓膠組織，進行原代培養，原代培養采用 MesenGro培養液培養，MesenGro培養液包括MesenGro培養基、胎牛血清、青霉素和/或鏈霉 素雙抗、阿卡米星、成纖維細胞生長因子，帶細胞游出后，用胰蛋白酶消化離心，得到原代人 臍帶間質干細胞；

(2)傳代培養：對得到的原代細胞置于新的MesenGro培養液進行傳代培養，待細胞 長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化離心，得到第二代細胞；并使用同樣方法得到重復 進行第二代到第三代傳代人臍帶間質干細胞的培養。

優選地，步驟(1)中，所采用的胎牛血清的濃度為5％～20％，青霉素/鏈霉素雙抗 的濃度為80～120U/mL，阿卡米星的濃度為5～10mg/L，成纖維細胞生長因子的濃度為8～13 μg/L。

優選地，步驟(1)中，培養溫度為37℃，環境空氣為5％CO₂。

優選地，步驟(2)中，培養溫度為37℃，環境空氣為5％CO₂。

一種人臍帶間質干細胞分化誘導為軟骨細胞的培養方法，取上述第三代傳代臍帶 間質干細胞，與人關節軟骨細胞(hACs)共培養，誘導分化為軟骨細胞。

優選地，所述人關節軟骨細胞(hACs)的獲取方法為，取膝關節非負重區軟骨，使用 Ⅱ型膠原酶消化后過濾，棄上清液，收集軟骨細胞，接種于培養瓶內，使用含10％胎牛血清 的DMEM/F12培養基培養。待細胞達到80％～90％融合時，消化傳代成第1代細胞，然后再對 第一代細胞置37℃、5％CO₂的培養箱中繼續培養，獲得第2代人關節軟骨細胞(hACs)。

優選地，軟骨細胞的培養方法為，將第三代傳代人臍帶間質干細胞與第二代人關 節軟骨細胞(hACs)，按1：1的比例接種于DMEM/F12培養液中，進行共培養。

臍帶間質干細胞和軟骨細胞共培養，兩種細胞相互促進增殖和分化，可減少軟骨 細胞增殖傳代次數并節省軟骨細胞數量，方法簡單，費用低，生物安全性高，對建立種子細 胞源是一種實用的策略，也為優化和擴大軟骨組織工程的種子細胞源提供了實驗依據。

附圖說明

圖1A實施例1利用流式細胞儀對第三代傳代人臍帶間質干細胞表面抗原CD34和 CD45的檢測結果

圖1B實施例1利用流式細胞儀對第三代傳代人臍帶間質干細胞表面抗原CD105和 CD73的檢測結果

圖2A實施例2利用流式細胞儀對第三代傳代人臍帶間質干細胞表面抗原CD34和 CD45的檢測結果

圖2B實施例2利用流式細胞儀對第三代傳代人臍帶間質干細胞表面抗原CD105和 CD73的檢測結果

圖3A實施例1利用RT-qPCR技術對SOX9基因的轉錄情況表征

圖3B實施例1利用RT-qPCR技術對I型膠原基因的轉錄情況表征

圖3C實施例1利用RT-qPCR技術對Ⅱ型膠原基因的轉錄情況表征

具體實施方式