[發(fā)明專利]超級細(xì)菌Steno熒光定量PCR檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610040885.7
• 申請日: 2016-01-20
• 公開（公告）號: CN105506139B
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鐘明;李香梅
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽達(dá)健醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種超級細(xì)菌Steno熒光定量PCR檢測用引物及探針，其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；探針序列如SEQ ID NO.3所示；所述探針的5′端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明還公開了超級細(xì)菌Steno的檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明針對超級細(xì)菌Steno設(shè)計了特異性引物和熒光探針，提高檢測敏感性和特異性，假陽性低；本發(fā)明的檢測試劑盒檢測靈敏度高，特異性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種超級細(xì)菌Steno熒光定量PCR檢測試劑盒，屬于細(xì)菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

“超級細(xì)菌”(super bacteria)是指一些絕大多數(shù)高效抗菌素都戰(zhàn)勝不了的耐藥細(xì)菌。當(dāng)人體被這種“超級細(xì)菌”感染后，醫(yī)療上往往治療棘手，選擇有效抗菌素困難?！俺壖?xì)菌”容易在醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)中傳播，其后果常導(dǎo)致患者死亡，因而引發(fā)對“超級細(xì)菌”的恐慌和不安。近年來隨著抗菌藥物、抗腫瘤化療藥物及免疫抑制劑的廣泛使用，全球的細(xì)菌耐藥情況日趨嚴(yán)峻，目前感染病專家們認(rèn)為的“超級耐藥細(xì)菌”主要有：耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐萬古霉素的葡萄球菌(VRSA)、耐萬古霉素的腸球菌(VRE)、耐碳青霉烯類的腸桿菌科細(xì)菌(包括NDM-1)、多重耐藥的銅綠假單胞菌(MDR-PA)、泛耐藥的鮑曼不動桿菌(PDR-AB)、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBL)的腸桿菌科細(xì)菌、多重耐藥的結(jié)核桿菌(XTB)等。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas mahophilia，Steno)是一種嚴(yán)格的非發(fā)酵型需氧的革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于水、土壤、植物根系、人和動物的體表與消化道中，在自然界中的河水、污水及自來水中?？蓹z出，也可以從正常人口、咽部、痰、糞便中檢出。過去一般認(rèn)為該菌的毒力較弱，對人和其他動物的致病性不強(qiáng)，但近10年來發(fā)現(xiàn)Steno感染所致的疾病的發(fā)病率逐年增高，已成為人類重要的條件致病菌和重要的醫(yī)院內(nèi)感染菌，在醫(yī)院病人中的分離率在非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌中，僅次于銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)和不動桿菌而居第三位，其感染可致肺炎、敗血癥、腦炎、心內(nèi)膜炎、化膿性淋巴結(jié)炎和膿腫。Steno感染的死亡率高達(dá)43％以上，引起如此高的死亡率的主要原因是由于該菌能產(chǎn)生多種蛋白酶、核酸酶、透明質(zhì)酸酶等胞外蛋白致病因子，以及β-內(nèi)酰胺酶等，具有多重耐藥性，導(dǎo)致其對目前大多數(shù)的抗菌藥物不敏感所致；其次是該菌對一些最初敏感的抗菌藥物往往在治療過程中很快會產(chǎn)生耐藥，從而導(dǎo)致治療的失敗，引起死亡，這給該菌感染的治療帶來很大的困難。因此，加強(qiáng)對該菌耐藥性的監(jiān)測，盡早檢測和發(fā)現(xiàn)致病菌，有助于在臨床治療上更為有效、合理的選擇藥物，為制定更為科學(xué)、合理的防治措施提供科學(xué)的理論依據(jù)。

目前對超級細(xì)菌Steno的檢測尚缺乏有效的方法，API20NE鑒定系統(tǒng)等傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法耗時長且缺乏敏感性和特異性；常規(guī)PCR的操作過程較煩瑣，包括增菌、擴(kuò)增、電泳等步驟，既費時又易污染而導(dǎo)致假陽性的發(fā)生。

實時熒光定量PCR技術(shù)(rea1-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它是一種在PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時，探針結(jié)合在DNA任一一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。