[發明專利]一種預防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗及其制備方法有效
| 申請號： | 201610040427.3 | 申請日： | 2016-01-21 |
| 公開（公告）號： | CN105457023B | 公開（公告）日： | 2019-10-08 |
| 發明（設計）人： | 蔡家利;宋梅;吳勝昔;王遠強;許雁;戶國達;張羿;肖紅;王璐 | 申請（專利權）人： | 重慶理工大學;重慶拜洛德生物制品有限公司 |
| 主分類號： | A61K39/145 | 分類號： | A61K39/145;A61K39/39;A61P31/16;C12N15/44;C12N15/866;C12N7/04 |
| 代理公司： | 重慶博凱知識產權代理有限公司 50212 | 代理人： | 張先蕓 |
| 地址： | 400054 重*** | 國省代碼： | 重慶;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 預防 h9n2 流感病毒 顆粒 疫苗 及其 制備 方法 | ||
1.一種預防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗，其特征在于，其組分包括H9N2型流感病毒樣顆粒；其中，所述H9N2型病毒樣顆粒為H9N2型流感病毒的病毒樣空殼顆粒結構，所述空殼顆粒結構的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的結構蛋白；
所述結構蛋白為H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神經氨酸酶NA蛋白和基質蛋白M1；其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼所述HA蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，編碼所述NA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，編碼所述M1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述疫苗的組分還包括佐劑；所述佐劑為微球佐劑；
所述微球佐劑采用如下方法制備：
1）將乙酸、吐溫-80、水和殼聚糖混合均勻，配制成混合溶液，所述混合溶液中殼聚糖的質量濃度為0.25%~0.3%、乙酸的質量濃度為2%~2.5%、吐溫-80的質量濃度為1%~1.2%；
2）在磁力攪拌和超聲作用下，將質量濃度為10%~15%的Na2SO4溶液以1~1.2 mL/min的速度滴入步驟1）配制的混合溶液中，持續磁力攪拌和超聲作用20~25min后，以2750~3500r/min離心20~30min，用超純水清洗離心沉淀物，以2750~3500r/min離心20~30min，再次重復兩次洗滌離心后，將沉淀物冷凍干燥，得到微球佐劑；其中，所述Na2SO4溶液與所述混合溶液的體積比為1:100~120。
2.一種如權利要求1所述預防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
1）根據權利要求1所述SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，合成HA、NA和M1基因，并設計合成HA、NA和M1基因的引物，供檢測之用；其中，HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，HA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，NA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，M1基因的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，M1基因的下游引物序列如SEQ ID NO.12所示；
2）用限制性內切酶BamHI和NotI對昆蟲桿狀病毒表達載體pFastBac-DuaL和合成的M1基因進行酶切并連接過夜后，轉化入感受態細胞進行培養，抽提陽性克隆的重組質粒DNA，得到重組質粒pFastBac-DuaL-M1；所述感受態細胞為DH5a感受態細胞；
3）用限制性內切酶SmaI和NheI酶對步驟2）得到的重組質粒pFastBac-DuaL-M1和合成的HA基因進行酶切并連接過夜后，轉化入感受態細胞進行培養，抽提陽性克隆的重組質粒DNA，得到重組質粒pFastBac-DuaL-HA-M1；
4）用限制性內切酶SmaI和NheI酶對步驟3）得到的重組質粒pFastBac-DuaL-HA-M1和合成的NA基因進行酶切并連接過夜后，轉化入感受態細胞進行培養，抽提陽性克隆的重組質粒DNA，得到重組質粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1；
5）將步驟4）得到的重組質粒pFastBac-DuaL-HA-NA-M1轉導入E.coLi感受態細胞株DH10Bac細胞中，并經過藍白篩選，挑取白色菌落，并提取質粒，得到質粒rBacmid-HA-NA-M1；
6）將步驟5）得到的質粒rBacmid-HA-NA-M1轉染SF9昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒；
7）將步驟6）得到的重組桿狀病毒感染SF9昆蟲細胞，培養后收集上清液，并對上清液進行純化，得到H9N2型流感病毒樣顆粒；
8）將佐劑溶于步驟7）得到的所述H9N2型流感病毒樣顆粒中，于37℃下孵育3h后，離心棄去上清液，對沉淀進行清洗，即得到所述預防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗。
3.根據權利要求2所述預防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗的制備方法，其特征在于，步驟3）和步驟4）中所述感受態細胞均為E.coLiDH5a感受態細胞。
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