[發明專利]一種利用自殺基因快速篩選細菌群體感應抑制劑的方法

有效

• 申請號: 201610039619.2
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105504002B
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 林向民;姚祖杰;林文雄
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C07K1/04
• 分類號: C07K1/04
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供一種利用自殺基因快速篩選細菌群體感應抑制劑的方法，在自然光下，沒有被噬菌體侵染的細菌不顯藍色，噬菌體侵染的細菌顯藍色；在加入致死條件誘導劑誘導下，具有抑制QS功能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動自殺基因的表達，因此存活；而非特異多肽無法抑制QS分子，導致自殺基因啟動致死；然后將存活的候選克隆挑出來，進一步功能驗證，最后通過DNA測序的方法獲得特異多肽序列對應的DNA序列，從而獲得高效、特異的QSI多肽。本發明步驟簡單，只需要3天至一周左右的時間，就可以獲得多個QSI候選多肽，因此具有非常明顯的優勢。

技術領域

本發明涉及基因工程與適體技術，公開了針對篩選細菌群體感應抑制物的噬菌體展示技術。具體而言，特指一種篩選細菌群體感應抑制物的技術，該方法同樣也適用于長、短鏈N-酰基高絲氨酸內酯類(AHLs)的群體感應分子抑制物的篩選。本發明中涉及的噬菌體展示技術可適用于例如噬菌體抗體庫、環肽、線性多肽等帶有隨機文庫的任何噬菌體文庫。涉及的宿主菌為可以被噬菌體文庫侵染的雄性F’細菌，例如ER2738、DH5α F’、XL1-Blue，涉及的載體為加入QS分子可導致自身基因誘導細菌死亡的載體pSB537。屬于病原微生物預防與控制領域。

背景技術

細菌耐藥的形勢嚴峻，如何提高新藥研發速度，抑制或殺死病原菌的要求迫在眉睫。目前新藥的開發主要有幾種方法：一是傳統的經典方法，即從自然環境例如土壤或者植物中篩選天然抗生素或者抗菌物質。但篩選天然抗菌物質的方法存在著過程繁瑣，工作量大等問題，需要在篩選規模與通量上得到質的提高；二是人工合成或者半合成的抗生素，通過修改一些化學修飾改變化合物結構，提高藥效。但由于同類合成的抗生素都具有類似化學結構和作用機理，因此容易對同類耐藥細菌產生抗性；三、近十幾年來在國際知名藥物公司和科研機構中發展十分迅速的高通量藥物篩選技術，使新藥的大規模篩選、靶點確認、自動化以及效價評估成為可能。同時，該技術也面臨著篩選模型與數據庫有限的技術難題；除上述幾種抑菌方法以外，還有一些利用細菌特殊生理功能以及重要靶點的新型抑菌藥物正在研究開發。例如消除細菌生物膜生成、抑制細菌群體感應以及抗體靶向抑制耐藥菌的策略。這些方法為新型藥物開發提供了新的思路，有待于進一步研究。

細菌的群體感應（QS, quorum sensing）是指細菌根據自身細胞密度變化進行基因表達調控的群體行為，研究發現，自然界中大部分的細菌都存在QS現象，它不僅控制細菌的生物發光，還與生物被膜和孢子生成、毒素分泌、質粒轉移以及包括抗生素在內的第二代謝產物合成緊密相關。目前已知的細菌QS系統，可以根據分泌的化學信號分子性質（又稱為自誘導物，AI, autoinducer）分為以下4類：一類信號分子為AI-1，是N-酰基高絲氨酸內酯類（AHLs）及其衍生物, 廣泛分布在革蘭氏陰性細菌中并具有種屬特異性。該類分子作用機理的研究相對比較透徹：AHLs分子由一系列具有相同高絲氨酸內酯環和不同碳原子數目和飽和程度的酰胺側鏈構成，N側鏈中的碳原子數多為偶數（只有C7一個奇數），從C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基團。如圖1所示，以費氏弧菌為例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并擴散到細胞外，當細胞密度增加到一定閾值時，AHLs與LuxR家族蛋白結合，從而使LuxR族蛋白與DNA上的調控元件結合，起始轉錄LuxCDABEG，啟動生物發光過程；第二類是由LuxS家族蛋白形成的自誘導物AI-2，其主要成分為呋喃酮酰硼酸酯。文獻報道AI-2在多種革蘭氏陽性和陰性細菌中存在，是不同物種細菌間相互聯系的通用信號。另外兩類是在革蘭氏陽性細菌中獨有的寡肽類分子 AIP（Autoinducing peptide）以及目前機制還尚未完全清楚的腎上腺素/去甲腎上腺素信息系統（AI-3）信號分子。

由于QS在細菌的生命活動中所起的重要作用，抑制細菌群體感應并不影響細菌的生長，但卻可以減少生物膜的生成、影響細菌毒素的分泌并且很難產生耐藥性，因此，開發針對QS相關基因或者其分泌的信號小分子物質的抑制物，稱之為群體感應抑制劑（QSI，quorum sensing inhibitor）或者群體感應淬滅（QQ，quorum quenching），是一個具有廣闊應用潛力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物來源，成為當前藥物開發研究的熱點。