[發明專利]穿心蓮內酯在治療骨關節退行性病變藥物中的應用

在審

• 申請號: 201610038936.2
• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105640938A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 趙勁民;鄭立;陸真慧;靳攀
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: A61K31/365
• 分類號: A61K31/365;A61K36/19;A61P19/02
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標代理有限責任公司 45106
• 代理人: 黎明天

技術領域

本發明涉及醫學領域，具體地涉及穿心蓮內酯對白介素-1β（IL-1β）誘導軟骨細胞 的保護作用及以穿心蓮內酯為原料在制備治療骨關節退行性病變藥物中的應用。

背景技術

骨關節退行性病變是臨床亟待解決的一個難題，臨床上由于創傷和各種疾病如骨 關節炎、骨壞死等造成骨關節退行性病變很常見。骨關節退行性病變治療已成為近年來骨 科及相關領域基礎和臨床研究的熱點和難點。目前研究表明，多種生長因子在骨關節退行 性病變的治療中發揮重要作用，包括TGF-β1、IGF-1、FGF等。但是目前常用的生長因子存在 提取工藝復雜、價格昂貴、容易降解等諸多弊端，不利于廣泛的臨床應用。由于關節軟骨細 胞是軟骨中唯一的細胞成分，而關節軟骨細胞是軟骨基質合成及組織功能代謝的平衡的關 鍵，可見關節軟骨細胞對關節軟骨的重要性。因此，急需開發和尋找更易提取，成本低廉，同 時具有保護軟骨細胞、改善軟骨代謝、維持軟骨完整性作用的藥物用于改善骨關節退行性 病變。

穿心蓮(Andrographispaniculata(Burm.f)Ness)又名春蓮秋柳、苦膽草、金耳 鉤等，是爵床科穿心蓮屬植物，是廣西壯族民間止痛消炎常用草藥。其主要活性成分穿心蓮 內酯（Andrographolide,AD）具有祛熱解毒，消炎止痛之功效，對骨關節退行性病變的作用 尚無報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種改善骨關節退行性病變的安全有效、價格低廉、能推 廣應用的藥品。

為完成以上目的，本發明采用以下技術方案：

一、穿心蓮內酯的制備

提取方法：干燥的穿心蓮葉10kg粉碎后，用100L的75%乙醇冷浸，得到浸出液用活性炭 回流脫色，趁熱抽濾。回收乙醇，緩慢加水，放置析晶，抽濾，得到粗結晶物。粗結晶物用少量 水洗滌，95%乙醇加熱溶解，1%活性炭回流30min，過濾，濾液放置析晶，抽濾，得到白色粗結 晶201.54g。

純化方法：將白色粗結晶溶解于甲醇，上樣于中性氧化鋁柱。以乙酸乙酯-甲醇-水 不同比例即25:0.1:0；12:0.4:0；0:1:0；0:5:5；0:3.5:6.5進行梯度洗脫。薄層色譜跟蹤， 合并相似餾分。合并用0:3.5:6.5乙酸乙酯-甲醇-水洗脫的餾分，回收洗脫劑，得白色結晶 48.24mg。

二、穿心蓮內酯對體外IL-1β誘導軟骨細胞的保護

（1）軟骨細胞的提取：無菌條件下，從新西蘭乳兔的四肢骨頭的骨骺端分離出軟骨組 織，用胰酶消化0.5h，緩沖液（PBS）洗后加入二型膠原酶消化3h，將上清液轉入離心管 1000r/min離心5min，加入含有15%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養基重懸，細 胞培養放入37℃、5%CO₂及濕度飽和的培養箱中培養，每2～3天換一次液；細胞生長至90% 融合度時，用胰酶消化進行傳代，擴增至所需要的細胞數量。

（2）細胞毒性試驗：選用生長狀態良好的第一代兔關節軟骨細胞，PBS沖洗一遍，胰 酶消化收集細胞，計數后接種于96孔板中，每孔細胞量為5×10³個。待細胞貼壁后，將孔內 液體吸掉，加入含不同濃度穿心蓮內酯（0～50mM）的高糖DMEM培養基，每個濃度重復6個復 孔。培養三天后，每孔加入20μL的噻唑藍（MTT），培養箱孵育4h，棄上清液，每孔加入DMSO 200μL，570nm測吸收值。篩選出適宜濃度的穿心蓮內酯，用于下一步實驗。

（3）第一代細胞消化計數后，接種于24和6孔板中，每孔細胞量分別為2×10⁴、1× 10⁵個。細胞貼壁后，加入含有穿心蓮內酯的高糖DMEM完全培養基，1h后加入10ng/mLIL-1β 誘導24h，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Realtime-PCR）法檢測相關基因表達，免疫 組織化學法檢測相關蛋白的表達，從而鑒定穿心蓮內酯對IL-1β誘導軟骨細胞的保護作用。

三、穿心蓮內酯在改善骨關節退行性病變的應用