[發明專利]一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯免疫檢疫方法

有效

• 申請號: 201610036604.0
• 申請日: 2016-01-20
• 公開（公告）號: CN105675862B
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發明（設計）人: 李繼祥;范夢男;周琴;李昕;江勝;李歡
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙)11316
• 代理人: 滑春生

技術領域

發明屬于動物疾病診斷試劑領域，具體涉及一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯免疫檢疫方法。

背景技術

鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)是嚴重危害水禽養殖業的重要病原性細菌。由于RA的耐藥性嚴重，其導致疾病的最佳防控策略是菌苗免疫預防。我國有關部門僅批準滅活菌苗可商品化用于水禽養殖。由于菌苗在生產中的應用，也導致了鴨疫里默氏菌感染鴨與滅活菌苗免疫鴨在檢疫中難于區分。本發明公開一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯免疫檢疫方法，能區分鴨血清中特異性抗體是鴨疫里默氏菌感染后產生或免疫接種滅活菌苗后產生，也能用于鴨疫里默氏菌感染康復鴨的鑒別。

鴨是否感染鴨疫里默氏菌，可以用鴨疫里默氏菌分離鑒定、多聚酶鏈反應(PCR)技術、血清抗體檢測等方法進行確證，但現有的相關方法均存在不同的缺點，不能作為檢疫方法。

(1)鴨疫里默氏菌的分離鑒定：可以確切診斷該細菌的臨床感染，但存在操作復雜、耗時長、使用抗菌藥物治療的動物和康復期動物的假陰性率高，不適合于檢疫等。

(2)多聚酶鏈反應(PCR)技術：操作復雜，技術要求高，需要多種特殊儀器，只適于鴨感染后帶菌期檢疫、不適合于康復后的非帶菌動物的鑒別。

(3)血清抗體檢測：檢測抗體的血清學方法很多，但在鴨疫里默氏菌感染中應用較多的要是酶聯免疫吸附試驗。已有血清抗體檢測方法不能區分血清中鴨疫里默氏菌感染和滅活菌苗免疫誘導產生的抗體，同時存在細菌血清型的差異，也就不能用于鴨疫里默氏菌感染鴨的檢疫。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯免疫檢疫方法。

本發明的一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯免疫檢疫方法，包括以下步驟：

(1)將鴨疫里默氏菌肽酶S8蛋白10.0μg/ml作為檢測抗原在37℃振蕩包被聚苯乙烯酶標板2小時；

(2)洗滌后用2％牛血清白蛋白在37℃振蕩封閉30分鐘；

(3)洗滌，將待檢血清用磷酸鹽緩沖液(0.01M pH 7.4)按1∶200稀釋后加入酶標板孔振蕩反應45分鐘；

(4)洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鴨IgG溶液振蕩反應45分鐘；

(5)洗滌，加入TMB顯色液避光振蕩反應15分鐘；

(6)加入終止液后混勻，酶標儀在波長450nm測定吸光值(OD₄₅₀值)。

上述本發明的檢疫方法，步驟(1)的檢測抗原的稀釋液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液；步驟(2)(3)(4)(5)中所述洗滌的洗滌液為含0.05％吐溫-20的0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液，洗滌3次，每次3分鐘；步驟(2)中2％牛血清白蛋白的稀釋液為0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液；步驟(6)的終止液為2.0M硫酸。

本發明的檢疫方法，檢測結果，當鴨血清檢測的OD₄₅₀值≥0.130，則表明鴨感染鴨疫里默氏菌；檢測的OD450值＜0.130，則表明鴨未染鴨疫里默氏菌。

本發明的另一目的在于提供了一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯免疫檢疫方法的檢測抗原，包括：

(1)鴨疫里默氏菌肽酶S8基因或部分基因片段的原核和真核表達的重組蛋白；(2)從鴨疫里默氏菌純培養物中分離純化的肽酶S8蛋白及其片段。

具體實施方式

以下實施例用于進一步理解本發明的實質，但不以任何方式限制本發明的范圍。

實施例1檢測抗原的制備

(1)鴨疫里默氏菌肽酶S8基因部分序列的克隆與分析

根據鴨疫里默氏菌基因組DNA序列中肽酶S8基因的核苷酸序列設計一對帶有限制性內切酶位點的特異性引物SL(5-GGATCCCTCAATGCCTAGCGGTATGA-3)和SR(5-AAGCTTACACCTTTAGGCTGTTGGGT-3)，以鴨疫里默氏菌AF株(血清2型)細菌基因組DNA為模板進行PCR。

PCR體系(25μL)：10×Buffer 2.5μL、MgCL₂(25mM)2.0μL、dNTPs(2.5mM)2.0μL、引物SL(10uM)2.0μL、引物SR(10uM)2.0μL、Taq酶(5U/μL)0.25μL、模板DNA 2.0μL、ddH₂O 14.25μL。

PCR條件：95℃預變性2min；94℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸10min。