[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610036512.2
• 申請(qǐng)日: 2016-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105606804A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳潤(rùn)生;陳晟生;陳景容;林拱陽(yáng);詹先強(qiáng);朱鴻杰;蘇國(guó)華;祝志剛;吳金妃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

1.一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：其包括以下步驟：

1)篩選豬圓環(huán)抗原抗體陰性動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用豬圓環(huán)病毒滅活疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行1-2次免疫，每次1-2頭份；

2)最后一次免疫后14-21天，無(wú)菌采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清，將收集到的血清在56℃下滅活30min，然后用維持液對(duì)血清做倍比稀釋，得到不同稀釋度的血清，每個(gè)稀釋度的血清分別與豬圓環(huán)病毒抗原于37℃環(huán)境下中和30-60min，得到中和液；

3)用細(xì)胞板培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)密度達(dá)到50-80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.1-0.2mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，并在37℃下吸附40-60min，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對(duì)照細(xì)胞6孔；

4)在細(xì)胞板中加入維持液并置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后棄去細(xì)胞板中的維持液，換用新鮮的維持液，繼續(xù)置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h-48h；

5）棄去細(xì)胞板中的維持液，細(xì)胞采用間接免疫熒光法進(jìn)行丙酮固定、然后熒光染色、按Reed-Muench法計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)，并以此判定豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的效價(jià)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟1）用豬圓環(huán)病毒滅活疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行2次免疫時(shí)，2次免疫時(shí)間間隔為14-21天。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠、豚鼠、豬或兔。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟1）的免疫為多點(diǎn)免疫，所述多點(diǎn)免疫為2點(diǎn)、3點(diǎn)或4點(diǎn)免疫。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟2)無(wú)菌采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清的具體操作為：采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液，在室溫下靜置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min離心10-15min，在無(wú)菌環(huán)境下分離不少于0.5mL血清。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述維持液為MEM維持液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟2）的豬圓環(huán)病毒抗原的濃度為200TCID₅₀/0.1mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟2）的倍比稀釋，稀釋至血清與維持液的比例1:1024以上。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述步驟2）每個(gè)稀釋度的血清與豬圓環(huán)病毒抗原等量混合。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于：所述細(xì)胞板為96孔細(xì)胞板。