[發明專利]一種通過敲除其他代謝途徑進而提高反式-4-羥脯氨酸產量的生物合成方法

在審

• 申請號: 201610035648.1
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105543303A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 張震宇;王曉姣;姚動邦;黃建華;魏照輝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P13/24
• 分類號: C12P13/24
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種通過敲除其他代謝途徑進而提高反式-4-羥脯氨酸產量的生物合成方法，屬于微生物基因工程領 域。

背景技術

羥基-L-脯氨酸(簡稱：羥脯氨酸，Hydroxyproline，Hyp)為亞氨基酸，是L-脯氨酸羥基化后的產物， 根據其羥基化位置的不同，可分為3-羥脯氨酸(3-Hyp)或4-羥脯氨酸(4-Hyp)。羥脯氨酸(Hydroxyproline， Hyp)是膠原蛋白的主要組成成分，不屬于20種常見的氨基酸。

近些年來，Hyp的研究和開發已經引起醫藥、生化、食品及美容業等方面的廣泛關注。它可以作為化 妝品添加劑，具有抗氧化、抗輻射的作用；它具有減肥作用，可望成為比較理想的減肥藥物；具有多種生 理功能與獨特的生物活性，既可作為各種軟組織疾病的藥物，如結締組織受損、風濕性關節炎等，又可加 快傷口愈合，以及治療各種皮膚疾病；作為氨基酸注射液的重要組分，它對急慢性肝病所導致的低蛋白 血癥有一定的療效；它參與脂肪的乳化及紅細胞血紅素和球蛋白的形成，具有調節脂肪乳化等作用；它還 是多種藥物，如第三代抗生素、抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等的合成原料。

目前，生產羥脯氨酸的方法有化學合成法、生物組織提取法以及生物合成法。化學合成方法合成步驟 較多，成本高，不適合工業生產。而生物組織提取法利用動物蛋白來源如明膠、豬皮為原料，經酸、堿或 蛋白水解酶水解后提取羥脯氨酸，該法純化步驟長，成本高，浪費大量原料，且廢棄物污染嚴重，很容易 被市場淘汰。隨著DNA重組技術的發展以及微生物資源的發現，生物合成酶法生產羥脯氨酸成為工業上 很有前景的生產方法。

生物合成法能將游離的L-脯氨酸通過脯氨酸羥化酶的催化，轉化為羥基-L-脯氨酸，但在生物細胞中， 游離的脯氨酸也是一種可以被利用的碳源，其積累量比較有限，所以有必要切斷生物細胞內與L-脯氨酸競 爭前體底物谷氨酸的其他代謝途徑，使得L-脯氨酸得到大量積累，進而更多的轉化為羥基-L-脯氨酸，提 高羥基-L-脯氨酸產量。

本發明所提供的切斷分支代謝途徑進而提高提高羥基-L-脯氨酸產量的生物合成方法，具有重要的工業 應用價值。

發明內容

針對生物合成法生產羥基-L-脯氨酸時，需外源添加L-脯氨酸導致生產成本較高的缺點，本發明的目 的是提供一種通過提高底物L-脯氨酸積累量進而提高羥基-L-脯氨酸產量的生物合成方法。

本發明是一種通過提高底物L-脯氨酸積累量進而提高羥基-L-脯氨酸產量的生物合成方法。其特征是： 切斷生物細胞內與L-脯氨酸競爭前體底物谷氨酸的其他代謝途徑，使得L-脯氨酸得到大量積累，進而更多 的轉化為羥基-L-脯氨酸，提高羥基-L-脯氨酸產量。

本發明所述重組細胞的構建方法：

1.含有脯氨酸羥化酶基因的載體的構建

根據大腸桿菌密碼子的偏好性，利用密碼子的簡并性在不改變氨基酸序列的基礎上，消除低使用率的 密碼子，優化脯氨酸羥化酶基因，使得其更有利于在大腸桿菌中得到表達。同時，選用色氨酸串聯啟動子 作為其啟動子，對其進行優化，使得羥化酶基因得到更為高效的表達。

2.通過敲除基因argB切斷生物細胞內與L-脯氨酸競爭前體底物谷氨酸的精氨酸代謝途徑

谷氨酸起始的下游代謝主要包括脯氨酸、谷氨酰胺和精氨酸3個途徑。在精氨酸合成途徑中，三羧酸 循環代謝支路生成的谷氨酸不僅是精氨酸合成的前體，而且還是脯氨酸合成的前體，脯氨酸與精氨酸的合 成形成競爭關系。因此，切斷精氨酸合成支路有利于細菌體內代謝流向脯氨酸合成方向。

argB編碼的乙酰谷氨酸激酶NAGK是精氨酸生物合成一個關鍵酶，其受到精氨酸的反饋抑制和反饋 阻遏。乙酰谷氨酸激酶(N-acetyl-L-glutamatekinase，NAGK)是氨基酸激酶家族酶系之一，利用ATP催 化乙酰谷氨酸(N-acetyl-L-glutamate，NAG)的γ-COO群組磷酸化生成無水酰基磷酸鹽，且這個過程具 有可逆性。

敲除argB基因，可以有效的打斷細胞內由谷氨酸生成精氨酸的途徑，從而積累更多的L-脯氨酸，有 利于羥脯氨酸的產生。

3.重組大腸桿菌的發酵實驗