[發明專利]一種制備擁有類似天然狀態生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法

有效

• 申請號: 201610035565.2
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105543234B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 田長麟;張隆華;孫培蓓;王晨陽;周莉
• 申請（專利權）人: 合肥科生景肽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 合肥市上嘉專利代理事務所(普通合伙) 34125
• 代理人: 王偉

1.一種制備擁有類似天然狀態生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，包括如下步驟：

（1）獲取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；

（2）將SSD609的DNA序列連接到帶有His₆親和標簽和SUMO助溶標簽的pET28載體上，構建pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609質粒；

（3）將pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609質粒轉化進入大腸桿菌，培養后采用異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)誘導表達，離心后收菌；

（4）將細菌懸液超聲破碎后離心取上清液，用鎳柱純化，洗脫后得到純化的His₆-SUMO-SSD609融合蛋白；

（5）His₆-SUMO- SSD609融合蛋白用Factor Xa酶進行酶切，得到含有His₆-SUMO標簽和SSD609多肽毒素的蛋白混合液；將該混合液與鎳柱混合，His₆-SUMO標簽與鎳柱結合，而SSD609多肽毒素則作為流穿液被收集，并用HPLC進一步純化；

（6）經HPLC純化后的SSD609多肽毒素使用還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽進行二硫鍵重建，獲得狀態均一的SSD609多肽毒素；

（7）再次使用HPLC對SSD609多肽毒素進行純化，并質譜驗證SSD609的分子量大小，凍干備用。

2.根據權利要求1所述的一種制備擁有類似天然狀態生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步驟（3）中蛋白表達的具體方法如下：

將pET28-His₆-SUMO-Factor Xa-SSD609質粒轉化進入Escherichia coli BL21(DE3)gold細胞中，37 ℃ 培養箱中生長24 h；挑選單克隆，在4 mL LB小管中擴增后加入到600mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液態培養基中，37℃ 培養，轉速為225 rpm；當菌液OD600達到0.8時加入終濃度為0.5 mM IPTG進行誘導，融合蛋白開始表達，于25 ℃ 培養箱中培養；20h后離心機離心收菌，4000 rpm離心20 min，棄上清液；用35 mL裂解液重懸底部的E.coli細胞，收集細菌懸液，備用。

3.根據權利要求1所述的一種制備擁有類似天然狀態生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步驟（4）中蛋白純化的具體方法如下：

將細菌懸液用超聲破碎儀破碎，離心后取上清，得到含有雜蛋白的蛋白混合液；Ni²⁺-NTA膠先用ddH₂O沖洗，再用Binding buffer平衡；平衡后的Ni²⁺-NTA膠與蛋白混合液混合，使His₆-SUMO-SSD609蛋白與Ni²⁺-NTA膠結合；將結合了蛋白的Ni²⁺-NTA膠加入重力流穿柱，用含30 mM咪唑的Binding buffer洗去非特異性結合的雜蛋白，再用含有300 mM咪唑的Binding buffer洗脫His₆-SUMO-SSD609融合蛋白。