[發明專利]一種重組腺相關病毒的制備方法

有效

• 申請號: 201610035538.5
• 申請日: 2016-01-20
• 公開（公告）號: CN106987603B
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 吳陽;徐富強;何曉斌;林坤章
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢物理與數學研究所
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12R1/93
• 代理公司: 武漢東喻專利代理事務所(普通合伙) 42224
• 代理人: 胡星馳

本發明公開了一種重組腺相關病毒(rAAV)的制備方法，包括以下步驟：(1)將目標基因構建在重組型桿狀病毒上，所述重組桿狀病毒其基因組整合了制備rAAV所必需的腺相關病毒的Rep基因、Cap基因以及攜帶有目標基因的ITR核心表達元件；(2)將步驟(1)中制得的重組桿狀病毒感染宿主昆蟲幼蟲，使得所述宿主昆蟲幼蟲體內產生大量rAAV；(3)將步驟(2)中獲得的宿主昆蟲幼蟲裂解，提取rAAV并進行純化。本發明提供的方法，通過一種高度整合的重組桿狀病毒感染昆蟲幼蟲，從而大量制備品質穩定的基因治療用rAAV載體。

技術領域

本發明屬于基因治療領域，更具體地，涉及一種重組腺相關病毒的制備方法。

背景技術

重組腺相關病毒(rAAV)具有安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣、能介導外源基因在動物體內長期穩定表達等特點，是基因治療領域最具應用前景的載體之一。rAAV在神經科學研究以及疾病的基因治療等領域具有重要作用和巨大需求。有研究數據表明，一次大型靈長類動物試驗或臨床基因治療試驗就需要約10¹⁵VG(VG，virus genomes)的rAAV，是一般體外細胞試驗或小鼠試驗用量的成百上千倍(Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1935-43.)。

桿狀病毒(baculovirus)屬于桿狀病毒科，專一性寄生于節肢動物體內，多見于昆蟲綱的鱗翅目昆蟲，可感染600多種昆蟲。桿狀病毒是有囊膜的雙鏈環狀DNA病毒，其基因組大小在90kb-230kb之間，編碼上百種蛋白。1983年，smith首次利用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa Californica Multicapsid Nuclear Polyhedrosis Virus，AcMNPV)在草地貪夜蛾細胞系Sf9中成功表達了人β-干擾素，首創了桿狀病毒表達系統(Mol CellBiol,1983,3:2156-2165)。1985年，Maeda用家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori NuclearPolyhydrosis Virus，BmNPV)作為表達載體，在家蠶體內表達了人α-干擾素(Nature,1985,315:592-594)。此后，桿狀病毒表達系統不斷完善和發展，已經成為應用非常廣泛的一種真核表達系統。昆蟲是一類與腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)同屬于微小病毒科(parvoviridae)的濃核病毒亞科(Densovirinae)病毒的自然宿主。2002年，Urabe等人證實了感染桿狀病毒的Sf9昆蟲細胞可以支持AAV的復制，利用分別攜帶有AAV的Rep基因、Cap基因以及ITR核心表達元件的三種重組桿狀病毒共同感染Sf9細胞制備出了rAAV，成功建立了三桿狀病毒系統(Three Bac system),(Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1935-43.)。在此基礎上，研究者相繼開發出了更適合大規模制備rAAV的兩桿狀病毒系統(Two Bacsystem),(Mol Ther.2008May；16(5):924-30，Mol Ther.2009 Nov；17(11):1888-96.)以及依賴感染誘導表達Rep基因和Cap基因的包裝細胞系的一桿狀病毒系統(One Bac system),(Proc Natl Acad Sci USA.2009 Mar 31；106(13):5059-64，Hum Gene Ther.2014Mar；25(3):212-22.)。

目前利用桿狀病毒系統大規模制備rAAV的方法，都是依靠重組桿狀病毒感染體外培養的特定的昆蟲細胞系，如Sf9、Sf21細胞等。然而體外細胞系培養工藝復雜，設備條件要求苛刻、生產成本高昂。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種重組腺相關病毒的制備方法，其目的在于利用一種重組桿狀病毒感染昆蟲幼蟲大規模生產重組腺相關病毒，由此解決現有的重組腺相關病毒生產方法工藝復雜、條件要求苛刻、生產成本高昂的技術問題。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種重組腺相關病毒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：