[發(fā)明專利]一種快速檢測小反芻獸疫病毒的RT-RPA檢測試劑盒及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610034074.6
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105567872B
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊洋;張志東;秦曉東;宋一鳴;胡高維;竇永喜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發(fā)明公開了一種快速檢測小反芻獸疫病毒的RT?RPA檢測試劑盒及其用途。所述試劑盒包括有一對引物和一條探針，所述引物的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，所述探針的序列如SEQ ID NO.3所示。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的試劑盒能夠特異性的檢測小反芻獸疫病毒，并且在同等條件下對綿羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口瘡病毒以及口蹄疫病毒等其他重要的羊感染病毒沒有擴(kuò)增，說明該方法具有很好的特異性。靈敏度實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的用于檢測小反芻獸疫病毒的RT?RPA引物和探針能夠在40℃下，擴(kuò)增20min的條件下最少可檢出150個(gè)拷貝的模板，且與RT?qPCR具有很高的符合度。因此，本發(fā)明的試劑盒能夠快捷、高效、靈敏的檢測小反芻獸疫病毒，為小反芻獸疫病毒的鑒別診斷提供了有效技術(shù)手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測小反芻獸疫病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種快速檢測小反芻獸疫病毒的RT-RPA檢測試劑盒及其用途，本發(fā)明屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

自PCR技術(shù)誕生以來已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術(shù)需要特殊昂貴的熱循環(huán)儀器以及熟練的操作人員，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以用在現(xiàn)場診斷以及實(shí)驗(yàn)條件差的地方。重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)自從2006年被英國TwistDx Inc公司開發(fā)出來以來，就被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。以此為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的運(yùn)行溫度在37℃-42℃之間。進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的體系(如exo試劑盒)，需要能夠激發(fā)和檢測熒光團(tuán)的恒溫裝置，比如酶標(biāo)儀或?qū)崟r(shí)檢測的熱循環(huán)儀。

自開發(fā)以來，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)上，比如用于檢測土拉弗朗西斯菌、細(xì)螺旋體、HIV-1DNA、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、天花病毒、B型鏈球菌、大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病毒性腹瀉病毒、黃熱病毒以及戈登病毒等病原。與常規(guī)方法相比較，等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)具有很高的敏感性和特異性，這促使不同的公司商業(yè)化不同的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，比如，環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，鏈置換擴(kuò)增(strand displacementamplification,Becton Dickson,USA)。LAMP技術(shù)已經(jīng)比較成熟，并且得到廣泛使用，到目前為止，已經(jīng)超過1000份關(guān)于LAMP在不同疾病診斷中應(yīng)用的科研文章。與RPA相比較，LAMP技術(shù)具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較麻煩(3對引物)，特異性相對較弱(能擴(kuò)增很多條帶)，時(shí)間仍然相對較長，以及易于污染等不足的地方。

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)又名小反芻獸偽牛瘟，是由小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的一種急性、烈性、接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率均非常高。OIE曾將該病列為法定必報(bào)的A類動物傳染病，一旦發(fā)現(xiàn)必須采取緊急嚴(yán)厲的措施控制和撲滅。自從1940年首次確認(rèn)該病的存在以來，該病隨后在大多數(shù)非洲國家、中東地區(qū)以及印度、巴基斯坦以及中國等國均有報(bào)道，對我國養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。PPRV基因組全長為15,948個(gè)核苷酸，含有6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼6個(gè)連續(xù)的非重疊的蛋白，這些蛋白以5`-L-HN-F-M–P/C/V-N-3`的順序編排。基于N蛋白的不同，PPRV可以被分為四大類，這種分類方式能很好的反映PPRV存在的地域差異。N蛋白雖然不具有免疫保護(hù)作用，但是該蛋白是PPRV編碼的所有蛋白中豐度最高以及最具有免疫原性的蛋白，這是N蛋白被廣泛的應(yīng)用到診斷方法的開發(fā)中的原因。