[發(fā)明專利]一種表達外泌體標記物的慢病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610033539.6
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105671082B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金衛(wèi)林;殷楚
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢淼靈生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 武漢維創(chuàng)品智專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42239
• 代理人: 余麗霞

1.一種表達外泌體標記物的慢病毒載體，是以慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro為出發(fā)載體進行改進，其特征在于，所述的表達外泌體標記物的慢病毒載體是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位點區(qū)域分別引入帶SBP標簽的CD63基因和CD9基因，同時在引入的CD63和CD9基因后面添加熒光能力強的綠色熒光蛋白ZsGreen1基因，所述的CD63-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述的CD9-SBP-ZsGreen1片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.如權(quán)利要求1所述的表達外泌體標記物的慢病毒載體，其特征在于所述的表達外泌體標記物的慢病毒載體為將慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的XbaI和NotI酶切位點之間分別包含CD63-SBP-ZsGreen1和CD9-SBP-ZsGreen片段的慢病毒載體。

3.如權(quán)利要求2所述的表達外泌體標記物的慢病毒載體構(gòu)建方法，其特征在于按如下的步驟進行：

1)根據(jù)GeneBank中人CD63、CD9的mRNA上CDS序列、SBP標簽序列、ZsGreen1標簽蛋白，設(shè)計XbaI-CD63-SBP-ZsGreen1-NotI和XbaI-CD9-SBP-ZsGreen1-NotI兩個DNA片段，送于上海Invitrogen公司合成；

2)分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和NotI酶切步驟1合成的雙鏈DNA分子，酶切體系：XbaI:1μL，NotI:1μL，緩沖液:3μL，合成的DNA序列:1μg，補充無菌水至30μL， 37℃酶切4小時，回收酶切產(chǎn)物；

3)用限制性內(nèi)切酶XbaI和NotI酶切出發(fā)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，酶切體系：XbaI:1μL，NotI:1μL，緩沖液:3μL，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro質(zhì)粒:1ug，補充無菌水至30μL，37℃酶切4小時，回收載體骨架；

4)將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，連接體系：T₄DNA連接酶:1μL，緩沖液:1μL，回收的合成DNA序列:20ng，回收的質(zhì)粒:10ng； 16℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性菌并提取其質(zhì)粒，得到重組載體pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro。

4.權(quán)利要求1所述的外泌體標記物慢病毒載體在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的外泌體標記物慢病毒載體在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于：利用權(quán)利要求1所述的表達外泌體標記物的慢病毒載體在細胞感染和細胞系構(gòu)建上的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的外泌體標記物慢病毒載體在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于：利用權(quán)利要求1所述的表達外泌體標記物的慢病毒載體在CD63和CD9外泌體SBP親和純化上的應(yīng)用。