[發明專利]鑒定純合型TT51-1和雜合型Bt汕優63的方法

在審

• 申請號: 201610032844.3
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105586407A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 李允靜;吳剛;萬丹鳳;武玉花;李俊;李曉飛;李均;朱莉
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

技術領域

本發明涉及分子生物學及轉基因檢測技術領域，尤其涉及一種基于微滴式數字 PCR鑒定純合型TT51-1和雜合型Bt汕優63的方法。

背景技術

近年來，水稻、玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲準種植 和生產，截止到2014年，世界范圍內已經有27種作物涉及357個轉化體在38個不同的國家和 地區獲準種植或用作加工原料，種植面積已達1．815億公頃，年增長率為3-4%，比2013年 的1．752億公頃增加了630萬公頃（James，2014，國際農業生物技術應用服務組織）。隨著 轉基因事件的不斷增加，給世界各國轉基因生物安全監管帶來越來越大的挑戰。2008年我 國啟動了轉基因生物新品種培育重大專項，加速我國轉基因生物的研發進程。經過八年的 潛心研究，在轉基因生物新品種培育重大專項的支持下，轉基因大豆、玉米、水稻、棉花、小 麥、牛等品種不斷出現。2009年，我國植酸酶玉米和轉基因抗蟲水稻（TT51-1和Bt汕優63）首 次獲得轉基因安全證書，2014年這3個品種再次獲得轉基因安全證書。轉基因監管是轉基因 產業健康發展的重要保障，隨著轉基因生物新品種培育研究成果產業化進程不斷加快，加 強轉基因生物安全監管成為我國當前十分緊迫的任務。

轉基因產品檢測標準物質是轉基因生物及其產品成分檢測的重要物質基礎，在制 備轉基因標準物質的程序和環節過程中，原材料純合度鑒定是制備標準物質的關鍵環節， 目前美國油脂化學家協會（AOCS）和歐盟標準物質和度量研究所（IRMM）鑒定純合度的方法 主要是采用傳統的育種方式或實時熒光定量PCR的方法（李允靜等，2013，中國農業科學）。 同時，研究發現采用傳統育種方式，需要通過多年多代自交，才能獲得純合轉基因材料，耗 時長，費時費力；而實時熒光定量PCR方法本身誤差大，對轉基因作物進行純合度鑒定時，誤 差比較大，給結果判定帶來很大困難。

數字PCR(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)作為DNA定量的新技術，實 現了單分子DNA絕對定量。世界上已經發展了三大數字PCR技術平臺：微流體芯片數字PCR、 親疏水芯片數字PCR和微滴式數字PCR，三種數字PCR技術平臺相比較，微滴反應能極大程度 分散反應體系，它可以有效消除抑制因子的作用，保證檢測過程中的擴增效率，對檢測低含 量目標核酸分子的樣品有良好的效果，微滴式數字PCR的靈敏度更高，成本更低更實用。微 滴式數字PCR為食品或飼料樣品尤其是轉基因食品的檢測提供了更為靈敏的方法，也為復 雜食品體系中低含量模板分子的檢測提供了一個新的潛在發展方向（DanyMorisset等， 2013，PlosOne）。微滴式數字PCR成功鑒定了轉基因抗蟲水稻T1c-19和轉人乳鐵蛋白基因 山羊134的外源基因拷貝數分別為2個拷貝和0.5個拷貝（姜羽，2014，農業生物技術學報）。 斯洛文尼亞科研人員采用微滴式數字PCR建立了歐盟授權的12種轉基因玉米品種的多重 PCR定量檢測方法（DavidDobnik等，2015，Analyticalchemistry）。

我們希望通過利用微滴式數字PCR技術，建立一種鑒定純合型TT51-1或雜合型Bt 汕優63轉基因抗蟲水稻品系的方法，進而為制備標準物質或原材料的鑒定繁殖工作奠定基 礎，保障材料背景的真實可靠。

發明內容

本發明的目的就在于克服現有采用傳統育種和應用實時熒光定量PCR方法鑒定轉 基因材料純合度存在的困難，提供一種基于微滴式數字PCR鑒定純合型TT51-1和雜合型Bt 汕優63的方法，所述的TT51-1是轉基因抗蟲水稻品種，Bt汕優63是TT51-1同常規水稻品種 珍汕97A雜交后的衍生品種。

本發明的目的是這樣實現的：

一、基于微滴式數字PCR鑒定純合型TT51-1和雜合型Bt汕優63轉基因植株的方法（簡稱 方法）

本方法是：

①收集

采用國家標準《轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲水稻TT51-1及其衍生品種定量PCR 方法》（農業部2122號公告—8—2014），

TT51-1引物序列：

TT51-1F：5’-AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG-3’，

TT51-1R：5’-GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA-3’；

TT51-1探針序列：