[發明專利]一種聯產Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢桿菌菌株及其構建方法

在審

• 申請號: 201610032668.3
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105602876A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 別小妹;高玲;陸兆新;呂鳳霞;趙海珍;張充
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;A01P1/00;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.一種枯草芽孢桿菌菌株，其特征在于：該菌株聯產Surfactin和Plipastatin，命名為 pB2-L，在2015年11月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 為CGMCCNo.11723。

2.一種重組質粒pDL-PSQ，其特征在于：該重組質粒序列如SEQIDNO.1所示，包括sfp 基因和degQ基因。

3.權利要求2所述的重組質粒pDL-PSQ，其特征在于：該重組質粒以P43基因為啟動子， amyE為同源臂。

4.一種聯產Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢桿菌的構建方法，其特征在于，該方 法包括如下步驟：

(1)設計引物對P43-F和P43-R、sfp-F和sfp-R、degQ-F和degQ-R；以B.subtilisfmbJ的 基因組DNA為模板，PCR擴增sfp基因和degQ基因；以B.subtilispB2基因組DNA為模板，PCR 擴增啟動子P43基因；

(2)設計引物對PS-F和PS-R，通過重疊延伸PCR擴增，獲得融合片段P43-sfp；

(3)用限制性內切酶進行酶切，并通過連接反應將degQ基因片段插入質粒pDL的酶切位 點之間得到質粒pDL-degQ；

(4)用限制性內切酶進行酶切，并通過連接反應將融合片段P43-sfp插入質粒pDL- degQ，最后獲得重組整合質粒pDL-PSQ；

(5)將重組整合質粒pDL-PSQ轉入B.subtilispB2菌株中，通過同源臂位點交換，將目 的基因P43-sfp-degQ整合到了基因組中，抗性篩選，獲得陽性轉化子，即為聯產Surfactin 和Plipastatin的枯草芽孢桿菌工程菌，命名為B.subtilispB2-L。

5.權利要求4所述的構建方法，其特征在于：步驟(1)通過PCR擴增，在啟動子P43基因中 引入EcoRI酶切位點，在sfp基因中引入BamHI酶切位點，在degQ基因中引入BamHI和SacI酶 切位點。

6.權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)所述引物對序列如下：

P43-F：如SEQIDNO.2所示；P43-R：如SEQIDNO.3所示；

sfp-F：如SEQIDNO.4所示；sfp-R：如SEQIDNO.5所示；

degQ-F：如SEQIDNO.6所示；degQ-R：如SEQIDNO.7所示。

7.權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)所述引物對序列如下：

PS-F：如SEQIDNO.8所示；PS-R：如SEQIDNO.9所示。

8.根據權利要求4-7任一項所述方法獲得的聯產Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢 桿菌。

9.權利要求8所述的枯草芽孢桿菌工程在革蘭氏陽性細菌、絲狀真菌抑制方面的應用。

10.權利要求8所述的枯草芽孢桿菌工程在桃軟腐病菌防治方面的應用。