[發明專利]一種基于納米探針C60的癌胚抗原的電化學免疫傳感器的構建方法在審
| 申請號： | 201610032386.3 | 申請日： | 2016-01-19 |
| 公開（公告）號： | CN105675697A | 公開（公告）日： | 2016-06-15 |
| 發明（設計）人： | 鄭香麗;周長利;夏方詮;田棟;花小霞;喬雪瑩 | 申請（專利權）人： | 濟南大學 |
| 主分類號： | G01N27/48 | 分類號： | G01N27/48;G01N27/327;G01N33/574;G01N33/543 |
| 代理公司： | 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240 | 代理人： | 李茜 |
| 地址： | 250022 山東省濟*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 基于 納米 探針 sub 60 癌胚抗原 電化學 免疫 傳感器 構建 方法 | ||
1.一種基于納米探針C60的癌胚抗原(CEA)的電化學免疫傳感器的構建方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)用Al2O3拋光粉打磨直徑為4mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗3min，氮氣吹干；以10mL含有濃度為1.0mmoL/L的HAuCl4溶液為底液，以GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極在-0.8～0.6V電位范圍內進行循環伏安掃描30圈后，將電極在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡過夜，用PBS(pH7.4)緩沖液沖洗得到金納米簇修飾玻碳電極(nano-Au/GCE)；
(2)取10μL1~2.5μg/mL的CEA第一抗體(Ab1)標準溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；
(3)取10μL質量分數為1~3%的BSA溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封閉非特異性結合位點，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(4)將10μL0.1pg/mL~1.0ng/mL的一系列不同濃度的CEA標準溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于與抗體特異性識別，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到CEA/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(5)滴加6~10μLAuNPsL-cys-C60標記CEA第二抗體(Ab2-AuNPsL-cys-C60)到上述電極表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，再取10μL10mmoL的四辛基溴化銨甲苯溶液滴涂到電極表面室溫下孵育10min后用PBS(pH7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于納米探針C60的CEA的電化學免疫傳感器(Ab2-AuNPsL-cys-C60/CEA/BSA/Ab1/nano-Au/GCE)。
2.根據權利要求1所述的一種基于納米探針C60的CEA的電化學免疫傳感器的構建方法，其特征在于所述步驟(5)中Ab2-AuNPsL-cys-C60的具體制作步驟為：
(1)AuNPsL-cys-C60的制備
在磁力攪拌下，將0.40g的L-cys加入到1.0mL7.1moL/L的NaOH溶液中，然后加入8mL乙醇繼續攪拌使得溶液充分混勻，將2mL1mg/mL的C60的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室溫下持續攪拌24h，用超純水離心洗滌3次得到L-cys-C60；將L-cys-C60重新分散到4mL超純水中，取2mL0.01mol/L的HAuCl4加入到上述溶液中攪拌24h，之后滴加0.03mol/L的抗壞血酸直至溶液成黑色，用超純水離心洗滌得到AuNPsL-cys-C60，將AuNPsL-cys-C60重新分散到2mL超純水中；
(2)Ab2-AuNPsL-cys-C60的制備
取0.2mL10μg/mL的Ab2在攪拌的條件下加入到2mLAuNPsL-cys-C60溶液中，室溫下攪拌30min后在4℃下孵育過夜，得到的混合溶液在9000r/s離心15min，棄去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)緩沖溶液中，得到Ab2-AuNPsL-cys-C60溶液。
3.根據權利要求1所述的制備方法制備的一種基于納米探針C60的CEA的電化學免疫傳感器的構建方法，其特征在于，用于CEA的檢測，檢測步驟如下：
(1)實驗在電化學工作站上進行，采用三電極體系以所制備的免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極，在PBS(pH7.4)緩沖溶液中進行測試；
(2)用差分脈沖伏安法對一系列不同濃度CEA標準溶液及未特異性結合CEA的電極進行檢測，掃描的電位區間為-0.4V~0.4V，掃描速度為100mV/s，記錄示差脈沖伏安圖，根據所得的峰電流值和CEA濃度的對數呈線性關系，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替CEA標準溶液進行檢測。
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