[發明專利]一種快速檢測副溶血性弧菌的方法

有效

• 申請號: 201610032264.4
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105548551B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 賴衛華;王景云;劉道峰;鄧省亮;山珊;熊勇華;魏華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體采用Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球集成免疫磁珠捕獲技術和免疫層析快速檢測副溶血性弧菌。

技術背景

副溶血性弧菌是常見的食源性致病菌之一，該菌主要來源于蝦、魚和貝類等海產品。據國家食源性疾病監測網報告，至1998年以來我國由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趨勢，且超過沙門菌食物中毒而躍居首位，成為最嚴重的食源性病原菌。人類食用該菌感染的海產品可引發腸胃炎和敗血癥等腸胃疾病，是我國部分沿海地區的食物中毒案例中的首要病原菌。

自1950年發現副溶血性弧菌至今，國內外檢測該菌的方法仍以常規分離培養法為主。該法操作復雜、檢測周期長(4-7d)，已不能適應衛生應急檢測的需要；ELISA法、PCR方法以及生物傳感器法對副溶血性弧菌檢測靈敏度高，然而它們需要較長的檢測時間、昂貴的儀器以及專業的技術人員。因此它是必須的建立快速、靈敏的檢測方法。

膠體金免疫層析試紙條以其操作簡單、快速(10-15min)、準確等特點成為基層篩選的重要工具，然而由于膠體金的光學信號有限，膠體金免疫層析試紙條的靈敏度不高，對副溶血性弧菌的檢測限通常不高于10⁵CFU/mL，這個缺陷限制了其在食品和農產品檢測中的應用。因此，提高試紙條的靈敏度將為副溶血性弧菌的檢測提供簡單、高效的途徑。

發明內容

本發明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的副溶血性弧菌定性、定量檢測技術。

本發明具體方案如下：

一種快速檢測副溶血性弧菌的方法，包括以下步驟：

1)納米微球的制備：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去離子水中，向溶液中通入氮氣并加熱到80-120℃，然后將3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反應2h；用永磁鐵從反應溶液中分離出黑色的固體物質用高純水清洗3～5次，得Fe₃O₄納米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄納米粒子用1-10mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應12h，在Fe₃O₄納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子；

c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL無水乙醇，1-10mL去離子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉聯釕(Ru(bqy)₃²⁺)混合，將混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，劇烈攪拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，用去離子水清洗備用；

d.將1mL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用該混合物復溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80℃ 300rpm攪拌1h，離心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球；