[發明專利]一種快速檢測單增李斯特菌的方法

有效

• 申請號: 201610032193.8
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105527427B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 賴衛華;王景云;劉道峰;鄧省亮;山珊;熊勇華;魏華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體采用Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球集成免疫磁珠捕獲技術和免疫層析快速檢測單增李斯特菌。

技術背景

單核細胞增生李斯特氏菌簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患的食源性致病菌。該菌在自然界中分布廣泛，并且在4℃冰箱保存的食物中仍能生長繁殖，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。單增李斯特菌極易污染肉、蛋、海產品、乳制品、蔬菜等食品，引起食物中毒和李斯特菌病的發生。李斯特菌病具有妊娠期感染多、胎兒嚴重并發癥多、免疫受損人群易發、腦膜腦炎幾率高、死亡率高等特點，嚴重威脅人類身體健康和社會經濟的發展。因此，建立有效的預警機制，做到早預防、早發現、早處理，對保障食品安全和預防李斯特菌病爆發具有重大意義。

目前檢測單增李斯特菌的金標準是傳統分離鑒定法，該方法需經過預增菌、選擇性增菌、分離培養、生理生化鑒定及血清型鑒定等步驟，整個過程繁瑣耗時(3-7天)；PCR方法、電化學方法以及生物傳感器法對單增李斯特菌檢測靈敏度高，然而它們需要較長的檢測時間、昂貴的儀器以及專業的技術人員。因此，建立快速、簡單、靈敏的檢測方法對食源性致病菌的檢測具有重要意義。

膠體金免疫層析試紙條以其操作簡單、快速(10-15min)、準確等特點成為基層篩選的重要工具，然而由于膠體金的光學信號有限，膠體金免疫層析試紙條的靈敏度不高，對單增李斯特菌的檢測限通常不高于10⁵CFU/mL，這個缺陷限制了其在食品和農產品檢測中的應用。因此，提高試紙條的靈敏度將為單增李斯特菌的檢測提供簡單、高效的途徑。

發明內容

本發明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的單增李斯特菌定性、定量檢測技術。

本發明具體方案如下：

一種快速檢測單增李斯特菌的方法，包括以下步驟：

1)納米微球的制備：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去離子水中，向溶液中通入氮氣并加熱到80-120℃，然后將3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反應2h；用永磁鐵從反應溶液中分離出黑色的固體物質用高純水清洗3～5次，得Fe₃O₄納米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄納米粒子用1-10mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應12h，在Fe₃O₄納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子；

c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL無水乙醇，1-10mL去離子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉聯釕(Ru(bqy)₃²⁺)混合，將混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，劇烈攪拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，用去離子水清洗備用；

d.將1mL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用該混合物復溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80℃ 300rpm攪拌1h，離心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球；