[發明專利]一種時間分辨熒光定量檢測PCT的試劑盒

在審

• 申請號: 201610031801.3
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105548567A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 鄭忠亮;董垚;夏其林;王會妙;孫秋菊;張麗媛
• 申請（專利權）人: 武漢菲恩生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

技術領域

本發明涉及免疫檢測技術領域，具體涉及一種時間分辨熒光定量檢測PCT的試劑盒。

背景技術

降鈣素原(PCT)是一種蛋白質，當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時它在血漿中的水平升高。PCT具有出現早、半衰期短、不受免疫抑制影響、且在全身和局部感染下都呈現正相關的增長等特點。基于此，PCT較大多數經典的炎癥因子(如TNF-a、IL-16、IL-6、CRP等)有更好的敏感性、特異性和實時性，在臨床檢測和監測有重要的實用價值。

現階段，臨床上PCT的檢測方法多見雙抗夾心免疫化學發光法、放射性免疫法、酶聯免疫法(ELISA)、免疫層析法等。

雙抗夾心免疫化學發光法具有敏感度高、所需時間短等優點，但是不能檢測正常人血中的PCT。

放射性免疫法是通過將放射活性分子共價交聯至PCT抗體免疫反應后測定放射活性分子的放射信號來間接定量檢測PCT的一種超微量分析方法。具有特異性好、靈敏度高(可達ng和pg級)、操作簡便、樣品制備簡單、精確定量等優點，但是該方法中操作人員會接觸到放射性物質，可能會損害操作人員的身體，而且檢測完成后怎樣處置放射性材料也是個嚴重的問題。

PCT的酶聯免疫檢測方法是雙抗夾心ELISA方法，將一對PCT單抗分別進行酶標板固化和酶標記，抗原抗體反應后，通過底物與酶的呈色反應，即可顯示特定抗原是否存在，并可根據呈色之深淺進行定量分析。具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、快速、樣品能量大等特點，不但能進行定性檢測也能定量檢測，但是耗時較長。

側向免疫層析法在疾病快速診斷、小分子快速檢測等領域已得到了廣泛的應用。其原理是將特異性的抗原或抗體包被到硝酸纖維素膜上，構成檢測線，將二抗包被在距離檢測線在2～3毫米的區域構成質控線。當樣本中的目標分子與帶有特定標記物的檢測抗體結合后，從硝酸纖維素酶的上樣端向吸水端層析。由于毛細管作用，復合物將沿著膜向前移動，但移動到檢測線時，樣品中的目標分子將被檢測線中的捕獲抗體捕捉而停留在檢測線，多余的檢測抗體則通過檢測線后被質控線的二抗所捕捉。常用的標記物為膠體金顆粒、熒光微球等。

PCT的膠體金免疫層析法通過靜電吸附將PCT抗體標記到膠體金顆粒表面，通過觀察膠體金顆粒在檢測線上的聚集顯色判斷檢測結果。具有快速、簡便、直觀等優點，但同時存在著以存在依靠肉眼識別、靈敏度低、無法精確定量、標記通過靜電吸附，標記產物不穩定等缺點。

PCT的免疫熒光層析技術是將PCT抗體共價結合于熒光微球表面的活性基團(-COOH、-NH₂)上，通過激發后檢測線是否產生熒光來判斷檢測結果，延續了膠體金免疫層析方法的優勢，同時具有高敏感度、完全定量、標記物穩定的優點。在醫學、動植物檢疫、食品安全監督各領域得到了日益廣泛的應用。

在生物流體和血清中的許多復合物和蛋白本身就可以發熒光，因此使用傳統的發色團進而進行熒光檢測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此將長衰減壽命的標記物與時間分辨熒光技術相結合，就可以使瞬時熒光干擾減到最小化。

發明內容

為了解決現有的幾種檢測PCT技術存在的上述缺陷，本發明提供了一種時間分辨熒光定量檢測PCT的試劑盒。

本發明提供的時間分辨熒光定量檢測PCT的試劑盒，包括熒光微球抗體復合物和免疫熒光試紙卡，其中，

熒光微球抗體復合物：是將PCT單抗標記于稀土熒光微球形成的復合體，將該復合體添加到槍頭中并凍干而成，作為檢測抗體；

免疫熒光試紙卡包括檢測試紙卡，檢測試紙卡由樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接并貼于襯板上構成；其中，硝酸纖維素膜上的檢測線位置包被有另一PCT單抗，質控線位置包被有羊抗小鼠多抗。

PCT單抗是由PCT抗原免疫小鼠獲得的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合的雜交瘤細胞產生，因此羊抗小鼠多抗可以與PCT單抗結合。

時間分辨熒光免疫分析(Timed-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是一種靈敏的高端定量免疫檢測技術，是以稀土熒光微球(鑭系稀土離子)作為標記物來標記抗原或抗體，因鑭系稀土離子Stokes位移大，避免了激發光和發射光的重疊二影響結果，而且鑭系稀土離子熒光壽命長，可以通過延長檢測時間來消除檢測物質本底熒光的干擾，提高了靈敏度，另外稀土元素的熒光強度高，同樣能夠提高檢測的靈敏度。常用的稀土熒光微球為EU熒光微球。