[發明專利]一種β-甘露聚糖酶活性的測定方法

在審

• 申請號: 201610031762.7
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105506059A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 葛菁萍;平文祥;趙丹;杜仁鵬;金曼
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 朗堅

技術領域

本發明涉及一種酶活檢測方法，具體涉及一種β-甘露聚糖酶活性的測定方法。

背景技術

β-1,4-D-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan,mannanohydrolase,EC.3.2.1.78)，簡稱 β-D-甘露聚糖酶或β-甘露聚糖酶(β-D-mannanase,β-mannanase)，是一類能夠水解含有β- 1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露糖(其中包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的水解內 切酶，屬于半纖維素酶類，可廣泛地用于工業、農牧業生產的多個領域，關于該酶的研究與 開發近年來一直受到許多科研工作者的普遍重視。β-甘露聚糖酶可以將多糖降解為低聚 糖，因生產原料和β-甘露聚糖酶來源的不同，甘露聚糖的水解產物、功能、性質及應用環境 也不盡相同。因此有效測定β-甘露聚糖酶活性是生產高活性酶的有效途徑，而傳統方法對 β-甘露聚糖酶的測定易受到發酵液中殘留培養基的影響，其結果嚴重偏離真實值。本發明 以Akino方法為基礎，研制出一種有效的測定地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)發 酵過程中β-甘露聚糖酶的活性大小。該方法的建立可以大大的減小發酵液中底物對酶活性 測定的干擾，使得測定準確性高，結果真實可靠，為研究發酵過程中有效的測定β-甘露聚糖 酶活性提供實踐指導。

發明內容

本發明涉及一種β-甘露聚糖酶活性的測定方法，其包括如下步驟：

(1)以緩沖液A和魔芋粉制備底物溶液；

(2)將粗酶液加入底物溶液中，在適宜溫度下反應；

(3)將粗酶液以與步驟(2)相同的比例加入緩沖液A中，在與步驟(2)相同的適宜溫 度下反應相同時間；

(4)在比色管中分別加入步驟(2)和步驟(3)的所得溶液以及DNS試劑，沸水浴顯色 后定容；步驟(2)所得溶液以底物溶液作為空白，步驟(3)所得溶液以緩沖液A作為空白，以 檢測OD550nm值；

(5)步驟(2)所得溶液OD550nm值減去步驟(3)所得溶液OD550nm值在標準曲線中查 找對應生成甘露糖的量，并通過下式計算β-甘露聚糖酶活力：

進一步地，所述緩沖鹽A為pH值＝4.0的Na₂HPO₄-檸檬酸緩沖液或CH₃COOH- CH₃COONa溶液。

進一步地，步驟(1)中所述底物溶液的魔芋粉濃度為0.1％-1.0％(w/v)，優選為 0.3％-0.7％(w/v)，更優選為0.5％(w/v)。

進一步地，步驟(2)中粗酶液與底物溶液的配比以及步驟(3)中粗酶液與緩沖液A 的配比為1:5-10(v/v)，優選為1:9(v/v)。

進一步地，步驟(2)和步驟(3)的反應溫度為50-60℃，優選為55℃；反應時間為20- 40min，優選為30min。

進一步地，還包括繪制甘露糖標準曲線的步驟。

本發明在原有酶活測定方法的基礎上研制出針對B.licheniformisHDGLJT-01利 用魔芋粉產β-甘露聚糖酶的酶活檢測方法，解決由于發酵液中殘留的魔芋粉和底物溶液中 未被消耗的魔芋粉使得酶活力結果較真實值偏高的問題，真實客觀的測定β-甘露聚糖酶成 為可能。該方法的建立為不同底物所導致酶活性測定不準確性的研究提供理論參考，為工 業化生產高活性的β-甘露聚糖酶提供實踐指導。

本發明以Akino方法為基礎，加入兩個對照組，以此消除試驗過程中發酵液中殘留 的魔芋粉造成的影響和底物溶液未被消耗的魔芋粉造成的影響。當以空白緩沖液做對照 時，所得的酶活力變化趨勢與實驗組基本相同，均呈現了先緩慢上升，而后下降的趨勢。而 以水為對照時，波動較大，酶活變化趨勢有時與實驗組變化趨勢并不完全吻合，此時此方法 并不能排除發酵液中魔芋粉的影響。可見，以空白緩沖液作為對照時，可以更準確的描述酶 活力變化趨勢。

附圖說明

圖1為當以水和緩沖液做對照時酶活力變化趨勢。

具體實施方式

實施例1、地衣芽孢桿菌種子液的制備