[發(fā)明專(zhuān)利]一種DBAT突變酶R363H及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610031523.1
• 申請(qǐng)日: 2016-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105602916B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林俊芳;郭麗瓊;尤琳烽;葉志偉;黃佳俊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/02
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
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本發(fā)明公開(kāi)一種DBAT突變酶R363H及其應(yīng)用。所述的突變酶是氨基酸序列為SEQ ID NO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由Arg改變?yōu)镠is；其氨基酸序列為SEQ ID NO：14。本發(fā)明成功構(gòu)建出突變酶R363H。該突變酶在利用乙酰輔酶A的催化效率上比野生型酶提高了12倍，大大提高了乙酰輔酶A的使用率和產(chǎn)物巴卡亭Ⅲ的產(chǎn)量。同時(shí)，為降低生產(chǎn)成本，本發(fā)明尋找了7種新型酰基供體，突變酶均能高效利用這些酰基供體，其中對(duì)乙酸乙烯酯的利用率提高了100倍，能作為替代昂貴的乙酰輔酶A用于制備巴卡亭Ⅲ。迄今為止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未發(fā)現(xiàn)有以非植物輔酶類(lèi)為酰基供體并體現(xiàn)高利用率的研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物分子催化領(lǐng)域，特別涉及一種DBAT酶(10-去乙酰基巴卡亭III-10β乙酰基轉(zhuǎn)移酶)突變酶R363H及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

定制酶一直是生物化學(xué)家?jiàn)^斗的目標(biāo)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的逐漸成熟，對(duì)蛋白序列進(jìn)行任意修改，可以解讀酶的催化機(jī)理并繼續(xù)理性設(shè)計(jì)酶。這種理性設(shè)計(jì)可以是增加已有酶的性質(zhì)，甚至是重新設(shè)計(jì)一個(gè)蛋白質(zhì)。

高催化活性酶是在生物產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮重要潛能的關(guān)鍵所在，也是現(xiàn)代蛋白質(zhì)工程研究的主攻方向。新型催化劑的理性設(shè)計(jì)往往會(huì)拓展我們對(duì)蛋白生化特性的認(rèn)識(shí)，尤其是那些錯(cuò)誤少、時(shí)間使用合理的蛋白質(zhì)理性改造過(guò)程。目前已利用理性設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)技術(shù)對(duì)天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特異性、熱穩(wěn)定性以及改進(jìn)酶的別構(gòu)效應(yīng)等進(jìn)行了成功的改造(Kries et al.,2013)。然而，理性設(shè)計(jì)方法僅適用于三維結(jié)構(gòu)清楚、結(jié)構(gòu)和功能的相互關(guān)系也較清楚的酶。

目前理性設(shè)計(jì)的思路仍然主要是由Hellinga和Richards于1991年提出的給蛋白增加新的結(jié)合位點(diǎn)的觀點(diǎn)。實(shí)際操作中，第一步在蛋白分子內(nèi)引入新的功能域，第二步再進(jìn)行優(yōu)化(Feldmeier et al.,2013；Koga et al.,2012)。

酶活性中心是酶催化的核心部位，其特定的構(gòu)象不僅有助于底物結(jié)合，還能促進(jìn)高效的催化作用。因此對(duì)酶活性位點(diǎn)改造相較整體蛋白質(zhì)的改造能更為直接，更為顯著的提升酶的催化活性(Kiss et al.,2013)。但是，酶的活性中心需要十分精確的構(gòu)象調(diào)節(jié)，它既需要一定的柔性去識(shí)別底物，完成催化反應(yīng)，又需要一定的剛性維持合理的構(gòu)象，來(lái)保持良好的生物學(xué)活性；酶的活性中心保持著柔性與剛性間的微妙平衡，隨意對(duì)活性中心的突變，會(huì)導(dǎo)致酶的迅速失穩(wěn)或者失活(Hilvert,2013)。

隨著學(xué)者們對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系認(rèn)知的逐步完善，計(jì)算生物學(xué)的迅猛發(fā)展，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)進(jìn)化酶學(xué)性質(zhì)的方法也日趨成熟。利用計(jì)算機(jī)模擬的方法，可以快速鑒定與催化直接相關(guān)的不可突變的氨基酸和有可能提升酶活性的靶標(biāo)位點(diǎn)，為蛋白質(zhì)工程改造提供快速的指導(dǎo)。

本發(fā)明通過(guò)合成生物學(xué)的手段，研究10-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基轉(zhuǎn)移酶的底物拓展和理性設(shè)計(jì)新酶，建立合成巴卡亭Ⅲ的新方法。本發(fā)明能通過(guò)高效制備巴卡亭Ⅲ從而極大的改善紫杉醇供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的首要在于提供一種DBAT突變酶R363H。該DBAT突變酶R363H比野生型DBAT酶具有更高的催化效率。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述DBAT突變酶R363H的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種DBAT突變酶R363H，是氨基酸序列為SEQ ID NO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)榻M氨酸(His)。

上述DBAT突變酶R363H的氨基酸序列為SEQ ID NO：14，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：13。

本發(fā)明另一方面涉及攜帶具有編碼序列為SEQ ID NO：13的DBAT突變酶R363H基因的重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒為pET-R363H。