[發明專利]磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器及方法

有效

• 申請號: 201610030637.4
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105675675B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 傅迎春;李玲艷;李延斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N33/569
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

1.一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器，其特征在于包括由磁珠轉化而成的普魯士藍和三電極系統，三電極系統以飽和甘汞電極為參比電極，碳電極為對電極，伴刀豆球蛋白A修飾磁珠標記電極為工作電極；

制備獲得作為參比電極的飽和甘汞電極和作為對電極的碳電極，所述伴刀豆球蛋白A修飾磁珠標記電極和普魯士藍具體制備過程如下：

1)處理磁珠水溶液制備獲得伴刀豆球蛋白A修飾磁珠分散液；

2)由伴刀豆球蛋白A修飾磁珠分散液處理獲得伴刀豆球蛋白A修飾磁珠標記電極；

3)將伴刀豆球蛋白A修飾磁珠標記電極置于鐵氰化鉀和硫酸鉀混合溶液中，采用三電極系統，伴刀豆球蛋白A修飾磁珠標記電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，碳棒為對電極，進行多電位階越掃描獲得普魯士藍。

2.根據權利要求1所述的一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟1)具體如下：

1.1)將磁珠水溶液在工作頻率為40kHz，功率為160W的超聲作用下分散5min，得到分散均勻的磁珠分散液；

1.2)將用于羧基化磁珠的檸檬酸與磁珠分散液混合，靜置于旋轉儀上12h過夜得到羧基化磁珠分散液，檸檬酸的含量為0.1mmol-0.3mmol每毫克磁珠；

1.3)將上述羧基化磁珠分散液依次進行磁性分離、去除上清液，然后將磁珠用磷酸鹽緩沖液清洗三次，然后分散于MES緩沖液中，使得磁珠的最終濃度為1mg/mL，4℃下保存；

1.4)將EDC和NHS加入到1mL上述羧基化磁珠的MES分散液中，常溫下攪拌反應2小時，用磷酸緩沖液磁性分離、去除上清液，重復清洗三次，得到活化磁珠，分散在1mL磷酸緩沖液中；

1.5)取活化磁珠與伴刀豆球蛋白A于常溫下反應，用磷酸緩沖液磁性分離、去除上清液，重復清洗三次，得到伴刀豆球蛋白A修飾磁珠，分散在1mL磷酸緩沖液中，在冰箱中4℃保存。

3.根據權利要求1所述的一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟1)具體如下：

2.1)將干凈的金磁電極在二硫雙琥珀酰亞胺基丙酸酯的丙酮溶液中浸泡，丙酮洗3次，然后超純水洗3次，獲得二硫雙琥珀酰亞胺基丙酸酯修飾金磁電極；

2.2)在二硫雙琥珀酰亞胺基丙酸酯修飾金磁電極上滴加伴刀豆球蛋白A溶液，常溫下反應，用PBS緩沖液清洗，獲得蛋白A修飾金磁電極；

2.3)在伴刀豆球蛋白A修飾金磁電極表面滴加禽流感病毒H5N1抗體溶液，常溫下反應，用PBS緩沖液清洗，獲得抗體修飾金磁電極；

2.4)在抗體修飾金磁電極表面滴加牛血清白蛋白溶液，常溫下反應以封閉非特異性結合位點，用PBS緩沖液清洗，最終獲得傳感電極；

2.5)在傳感電極表面滴加禽流感病毒H5N1懸濁液，常溫下培育，用PBS緩沖液清洗，獲得檢測電極；

2.6)取伴刀豆球蛋白A修飾磁珠分散液滴加到檢測電極表面，常溫反應，用PBS緩沖液清洗，獲得伴刀豆球蛋白A修飾磁珠標記電極。

4.根據權利要求3所述的一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器的制備方法，其特征在于：所述的干凈的金磁電極采用以下方式清洗：金磁電極依次在砂紙、0.5μm氧化鋁粉末和0.05μm氧化鋁粉末中打磨，打磨后經充分清洗，再依次在超純水、乙醇和超純水中各超聲5分鐘，配制Prihna溶液滴加5μL于電極表面，保持5分鐘，最后采用大量水進行清洗。

5.根據權利要求2所述的一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器的制備方法，其特征在于：

所述步驟1.2)中檸檬酸與磁珠分散液的配比為0.1mmol-0.3mmol每毫克磁性納米料子；所述步驟1.5)中活化磁珠與伴刀豆球蛋白A的質量比為1：5-1：10，時間為1h，反應時間為45-90min。