[發明專利]抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201610029748.3
• 申請日: 2016-01-16
• 公開（公告）號: CN105566492A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 張貫京;陳興明;張少鵬;高偉明;李慧玲
• 申請（專利權）人: 深圳市貝沃德克生物技術研究院有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C12N15/81
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，其特征在于，所述抗乙 肝表面抗原的熒光抗體的制備方法包括如下步驟：

S1：獲得M.BarkeriPylRS突變庫；

S2：獲得香豆素賴氨酸；

S3：篩選特異識別7-羥基香豆素的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶 (CouKRS)突變體；

S4：將步驟S3中的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶突變體的編碼基因 coukrs與畢赤酵母表達質粒pPICZ重組，獲得酵母表達質粒pPICZ-CouKRS；

S5：設計抗HBsAg抗體的突變DNA序列，獲得該突變體，將所述抗HBsAg 抗體的突變DNA序列與質粒pPIC9K重組，獲得酵母表達質粒 pPIC9K-antiHBsAg；

S6：將步驟S4獲得的pPICZ-CouKRS線性化，將步驟S5獲得的 pPIC9K-antiHBsAg線性化；

S7：將步驟S6線性化后的pPICZ-CouKRS和線性化后的 pPIC9K-antiHBsAg按照第一預設的比例混合，經過電擊轉化，導入到畢赤酵 母X33中，獲得菌株A；

S8：將步驟S7獲得的菌株A進行抗性篩選，獲得陽性菌株組B；

S9：將步驟S8獲得的陽性菌株組B分別進行PCR篩選鑒定，獲得若干 個陽性菌株組C；

S10：將步驟S9獲得的陽性菌株組C中的單克隆酵母涂布于含有G418 的YPDS固體培養基中培養，以驗證所述單克隆酵母的G418抗性，若驗證成 功，則獲得具備識別并攜帶7-羥基香豆素插入到抗乙肝表面抗原抗體的63位 點的單克隆酵母D；

S11：將步驟S10獲得的單克隆酵母D擴大培養、離心、超聲破碎以及鎳 柱純化得到抗乙肝表面抗原熒光抗體。

2.如權利要求1所述的抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，其特征 在于，所述步驟S1包括如下步驟：

S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；

S102：將上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列連接到pBK質粒上， 獲得重組質粒A；

S103：設計定點突變引物，所述定點突變引物包括引物f-Y349D、引物 r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物 r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；

S104：以所述重組質粒A為模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D 為引物，通過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫1；

S105：以所述突變庫1為模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I為引 物，通過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫2；

S106：以所述突變庫2為模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物 r-N311F313NNK為引物，通過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫3；

S107：以所述突變庫3為模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK 為引物，通過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫4；

S108：所述突變庫1、突變庫2、突變庫3和突變庫4按照第二預定的比 例混合，獲得用于7-羥基香豆素篩選用的M.BarkeriPylRS突變庫。

3.如權利要求2所述的抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，其特征 在于，所述第一預定的比例為1:1。

4.如權利要求1所述的抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，其特征 在于，所述步驟S2包括如下步驟：

S21：取第一預設量的間苯二酚，溶于水中，并加熱到90℃，滴加第二預 設量的蘋果酸，反應2小時后即可得到7-羥基香豆素A；

S22：取第三預設量的上述7-羥基香豆素A、賴氨酸和Licl水溶液于60℃ 攪拌，經過12小時；經液相色譜分離，濾膜過濾除菌，得到7-羥基香豆素母 液C。

5.如權利要求4所述的抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，其特征 在于，所述7-羥基香豆素母液C經過0.22微米濾膜過濾除菌。