[發(fā)明專利]一種基于代謝組學(xué)鑒別霍山米斛與霍山鐵皮石斛品種的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610029560.9
• 申請(qǐng)日: 2016-01-15
• 公開（公告）號(hào): CN105548404B
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金青;焦春燕;孫時(shí)偉;蔡永萍;林毅;宋程;李姝妹;王燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 合肥市上嘉專利代理事務(wù)所(普通合伙)34125
• 代理人: 王偉

1.一種基于代謝組學(xué)鑒別霍山米斛與霍山鐵皮石斛品種的方法，包括如下步驟：

（1）石斛樣品的采集；

（2）石斛代謝組學(xué)樣品的制備；

（3）石斛樣品代謝產(chǎn)物的檢測(cè)；

（4）代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的處理與分析；

所述步驟（2）的過程包括石斛樣品代謝物的提取及衍生化；

所述石斛樣品代謝物的提取步驟為：采用液氮研磨的方法將石斛樣品磨至粉末狀，每種石斛樣品取六次重復(fù)；然后稱取100~150mg粉末狀石斛樣品置于10mL離心管中，加入1.5mL預(yù)冷至-20℃的甲醇，渦旋震蕩1min后，加入60μL的核糖醇作為甲醇/水相的內(nèi)標(biāo)，再渦旋震蕩30s，然后用石臘膜封住離心管口，于40～45℃條件下超聲處理30min，8000rpm/min離心15~20min，取1mL上層溶液置于1.5mL離心管中，得到石斛樣品代謝物的甲醇/水相提取溶液；

所述石斛樣品代謝物的衍生化，具體步驟為：用氮?dú)獯蹈墒鷺悠反x物的甲醇/水相提取溶液， 加入60μL濃度20mg/mL鹽酸羥胺吡啶溶液，渦旋震蕩30s后40℃溫浴120min；隨后加入60μL含體積分?jǐn)?shù)1%TMCS 的BSTFA，密封后置37℃下反應(yīng)120min，即得所述石斛代謝組學(xué)樣品；

所述步驟（3）的檢測(cè)條件為：色譜條件：DB-5石英毛細(xì)管柱，毛細(xì)管柱規(guī)格30m × 250μm× 0.25μm；進(jìn)樣體積為1μL；分流進(jìn)樣，分流比為20：1；進(jìn)樣口溫度280℃；載氣為氦氣，流速1mL/min；程序升溫：初始溫度為100℃，保持2min，以 4℃/min 升溫到 260℃，保持1min，再以20℃/min 升溫到 280℃，保持3min；

質(zhì)譜條件：接口溫度和離子源溫度均為250℃；電子轟擊離子源；全掃描方式，電子能量70eV，質(zhì)量檢測(cè)范圍m/z 40-600；

所述步驟（4）代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的處理與分析包括：將步驟（3）獲得的霍山米斛與霍山鐵皮石斛GC-MS原始數(shù)據(jù)用Agilent MSD工作站打開，并轉(zhuǎn)換成CDF格式文件，然后導(dǎo)入R2.7.2軟件加載XCMS程序包進(jìn)行數(shù)據(jù)的預(yù)處理，獲得物質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積數(shù)據(jù)文件；用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行數(shù)據(jù)的歸一化處理，歸一化處理后數(shù)據(jù)導(dǎo)入simca-p11.5軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；

所述多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的具體內(nèi)容為：選取PCA和OPLS-DA模型進(jìn)行主成分分析以及差異性代謝物篩選；對(duì)所獲得的差異性代謝物利用NIST11數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，即獲得用于鑒定霍山米斛和霍山鐵皮石斛的特征性代謝產(chǎn)物。

2.如權(quán)利要求1所述的一種基于代謝組學(xué)鑒別霍山米斛與霍山鐵皮石斛品種的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，石斛樣品的采集包括霍山米斛和霍山鐵皮石斛樣品的采集，所述樣品液氮速凍后放-70℃超低溫下保存。