[發(fā)明專利]用于檢測(cè)耐碳青霉烯類腸桿菌試劑盒與檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610028329.8
• 申請(qǐng)日: 2016-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105671148A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張良祿;殷雷;洪昊巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢艾米森生命科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及碳青 酶烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè) 方法。

背景技術(shù)

碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺抗 生素，因其具有對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點(diǎn)，已經(jīng)成為治療嚴(yán)重 細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一。隨著其在臨床中的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類 抗生素出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，耐藥細(xì)菌表現(xiàn)為廣泛耐藥。2000年以前，未 見(jiàn)碳青霉烯酶廣泛流行的報(bào)道，更多的是AmpC酶或者ESBL合并膜孔蛋白 丟失造成碳青霉烯耐藥的報(bào)道；2001年，美國(guó)北卡羅來(lái)納州首次報(bào)道KPC (該菌是1996年在ICU分離出的一株細(xì)菌)；2004年，美國(guó)紐約布魯克林 地區(qū)報(bào)道了KPC的暴發(fā)流行；從1996年到2006年間，KPC風(fēng)行美國(guó)全國(guó)； 過(guò)去的十年，CRE逐漸成為威脅人類健康的一個(gè)重要問(wèn)題。碳青霉烯耐藥的 腸桿菌(Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae)或耐碳青霉烯腸桿 菌，包括腸桿菌、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌等，具有特點(diǎn)包 括(1)所致感染病死率高；(2)意味著泛耐藥，治療方案有限(3)位于質(zhì) 粒上的耐藥基因在不同種的細(xì)菌間傳遞；(4)耐藥轉(zhuǎn)移速度快：從院內(nèi)到社 區(qū)；因此對(duì)于耐藥菌株的快速檢測(cè)對(duì)于患者抗生素精準(zhǔn)治療，減少抗生素濫 用具有極為重要的臨床意義。

越來(lái)越多研究表明，細(xì)CRE耐藥機(jī)理主要包括：碳青霉烯酶與頭孢菌 素酶合并膜孔蛋白丟失。產(chǎn)碳青霉烯酶基因存在多重，包括KPC、NDM-1、 IMP、VIM與OXA-48等這5種最流行的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機(jī)制。 KPC是引起腸桿菌科細(xì)菌碳青酶烯主要原因，KPC的基因型已達(dá)約20種， 目前流行的主要是KPC-2和KPC-3；NDM基因大約有12種NDM基因型， 是引起全球關(guān)注的新發(fā)水解活性極強(qiáng)的碳青霉烯酶；IMP和VIM是臨床中 最為常見(jiàn)的金屬β-內(nèi)酰胺酶。OXA-48高度水解青霉素，輕度水解碳青霉 烯類藥物(活性中心無(wú)疏水橋)，對(duì)IPM的活性大于MEM。

目前用于CRE基因型檢測(cè)的方法有多種類型，包括PCR法、環(huán)介導(dǎo)等 溫?cái)U(kuò)增方法、基因芯片等，這些方法存在檢測(cè)通量低、集成程度差、檢測(cè)費(fèi) 用相對(duì)較高等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明針對(duì)爆發(fā)流行最常見(jiàn)、最關(guān)鍵的基 因，采用多重?cái)U(kuò)增技術(shù)，結(jié)合CFX96Touch^TM熒光定量PCR、biometra Toptical型熒光定量PCR等6通道檢測(cè)系統(tǒng)，單次反應(yīng)檢測(cè)以上五種基因 的多種亞型，為臨床工作者鑒定CRE基因型，縮短時(shí)間、降低成本具有極 大的臨床意義。

本發(fā)明目的之一提供一種用于檢測(cè)耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)的試劑 盒，試劑盒中包括下述組合物：檢測(cè)引物對(duì)和檢測(cè)探針。本發(fā)明的目的之二 還在于提供基于該檢測(cè)引物對(duì)和檢測(cè)探針的根進(jìn)一步的試劑盒及檢測(cè)方法。 本發(fā)明的組合物、試劑盒及檢測(cè)方法能夠多重?cái)U(kuò)增分別檢測(cè)KPC、NDM與 IMP、VIM、OXA-48等耐藥基因，并且實(shí)現(xiàn)耐藥基因定量測(cè)定。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供用于檢測(cè)耐碳青霉烯類腸桿菌的試劑盒，包括下述檢測(cè)引物 對(duì)中的至少一對(duì)：

檢測(cè)引物對(duì)1：

KPC上游引物為：5′-ATCGCCGTCTAGTTCTGCTG-3′，如SEQID NO.1所示，

KPC下游引物為：5′-TATCCATCGCGTACACACCG-3′，如SEQID NO.2所示；

檢測(cè)引物對(duì)2：

NDM上游引物為：5′-GCAAATGGAAACTGGCGACC-3′，如SEQ IDNO.4所示，

NDM下游引物為：5′-TCAAACCGTTGGAAGCGACT-3′，如SEQID NO.5所示；

檢測(cè)引物對(duì)3：

IMP上游引物為：5′-TTCAGTTGGTTCAGTTGTTGGTG-3′，如SEQ IDNO.7所示，

IMP下游引物為：5′-TGGATTAAATAGCCAAACTGACGC-3′，如 SEQIDNO.8所示；

檢測(cè)引物對(duì)4：