[發明專利]一種鑒別空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌雙重PCR引物及其鑒別方法

在審

• 申請號: 201610027763.4
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105420404A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 郭東春;曲連東;劉家森;劉春國;劉大飛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及一種雙重PCR引物及其鑒別方法。

背景技術

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)和結腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)屬于彎曲桿菌屬，是人畜共同感染的細菌性腸道病原菌，可以引起人和動物發生多種疾病。彎曲桿菌對動物和人類表現出不同程度的危害，禽類感染該菌一般會導致下痢、肝臟變性出血及產蛋下降為等癥狀，火雞則會引發肝炎和藍冠病；空腸彎曲桿菌還可引起羊流產，對養殖業造成極大的經濟損失。對人類致病主要表現為急性腸炎，免疫力低下者還會繼發格林-巴利綜合征(Guillain-Barrisyndrome，GBS)。彎曲桿菌主要通過飲水，食物等方式傳染給動物和人類，其感染的病例數已經超過李斯特菌病，沙門菌病和志賀菌病，在引起的感染中超過80％是由空腸彎曲桿菌引起，約10％是由結腸彎曲桿菌引起，其他彎曲桿菌也偶爾致病。

近年來，我國雞群大規模爆發彎曲桿菌病的報道也越來越多，雖然發病率高、死亡率低、多呈慢性經過，但其對雞群潛在的影響卻不容忽視，空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌感染的臨床癥狀不明顯且不易區分，因此很難通過臨床癥狀判斷感染情況。建立快速而特異的檢測方法是有效診斷空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌感染的關鍵所在。目前對彎曲桿菌的常規檢測鑒定主要是增菌培養生化鑒定，但是由于空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌在食品樣品中的含量很低，生長條件比較苛刻，常規檢測及鑒定方法繁瑣耗時，伴隨著假陽性和假陰性菌株的不斷發現，一些初步的生化試驗項目已經不能有效鑒別出空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌，傳統的鑒別方法面臨著巨大的挑戰,因此有必要尋找更加有效地鑒別空腸彎曲菌的檢測方法。近年來隨著分子生物學，特別是PCR方法快速發展，已成為快速，可靠和靈敏檢測病原體感染的工具。PCR檢測方法目前已經廣泛運用到細菌的分離鑒定之中，它具有快速簡單、特異性強和敏感性高等特點。已報道的PCR方法常用的靶基因有16SrRNA、23SrRNA、flaA或flaB、ceuE、cadF、hipO、cdtABC、glyA等，其中hipO是空腸彎曲桿菌所特有的，它可以有效鑒別空腸彎曲桿菌。細胞致死性膨脹毒素cdtC，是結腸彎曲桿菌重要的毒力因子之一。

發明內容

本發明提供了一種鑒別空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌雙重PCR引物及其鑒別方法。

本發明選擇hipO，cdtC為靶序列，設計特異性引物，建立雙重PCR方法用于空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌的鑒別。

本發明的一種鑒別空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌雙重PCR引物，是根據GenBank中發表的空腸彎曲桿菌hipO基因序列和結腸彎曲桿菌cdtC基因序列，設計2對特異性引物，具體如下：

hipOFATCAACATTGCGAGATAC；

hipORTAGACTTACAAGGCGAAT；

cdtCFGGATATGCACTCTCAAGATTTG；

cdtCRCTTGCTTAGTTCGGTTACAATAG。

本發明的一種鑒別空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌的雙重PCR方法，它是按照以下步驟進行的：

一、提取待檢測樣本的基因組DNA；

二、以步驟一的基因組DNA為模板，將上述的引物對放入同一PCR反應體系中，進行PCR擴增；

三、PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測；

四、對擴增片段進行分析：在653bp和313bp位置有兩條擴增條帶，表示樣品為陽性，待檢測樣品中同時含有空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌。

本發明包含以下有益效果：