[發明專利]百合總蛋白的提取及雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法

有效

• 申請號: 201610027384.5
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105527332B
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 張藝萍;王繼華;楊秀梅;瞿素萍;許鳳;王麗花;蘇艷;張麗芳
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院花卉研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 康珉

1.百合總蛋白的提取及雙向電泳差異蛋白質圖譜的獲取方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)百合總蛋白質的提取：

①稱取1～2g新鮮百合葉片或鱗莖于-20℃預冷的研缽中，加入10～20ml液氮，快速研磨至粉狀；

②量取20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫蘇糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液，分2～3次清洗研缽，將研缽內粉狀物清洗至50ml離心管中，迅速置于-20℃冰箱中保存過夜；取過夜的離心管于離心機上20000rpm，離心20min；棄上清；

③加入20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫蘇糖醇的80％的丙酮溶液，用槍頭把離心管內的沉淀弄碎，振蕩，于-20℃冰箱中放置2h后，取出離心管于離心機上20000rpm，離心15min，棄上清；

④重復步驟(1)③2次；

⑤在超凈工作臺上將得到的沉淀轉移到經干燥滅菌的培養皿中，待沉淀吹干后，即為提取的蛋白質干粉，將蛋白質干粉收集到離心管中，-80℃保存；

(2)百合總蛋白質的純化和溶解

①稱取步驟(1)⑤提取的蛋白質干粉40～50mg于底部連接有離心管的過濾柱中，按每1mg蛋白質干粉加7M水化液15μl的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室溫放置1h；

所述7M水化液的制備方法為：稱取8.4g尿素、3.04g硫脲、0.8g 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽于50ml離心管中，并用超純水稀釋至20ml；隨后將其分裝至1.5～2ml的離心管中，每個離心管中分裝1ml，備用；

②將底部連接有離心管的過濾柱于離心機上12000rpm，離心15min，然后棄去過濾柱，將過濾柱底部連接的離心管所收集到的濾液轉移至另一離心管中；

③加入1600～2000μl附加0.1％二硫蘇糖醇的無水丙酮，邊加邊搖勻，-20℃冰箱中放置2h后，取出離心管于離心機上15000rpm，4℃離心30min，棄上清；

④加入1ml在4℃預冷的附加0.1％二硫蘇糖醇的超純水，在離心機上15000rpm，4℃離心25min，棄上清；

⑤加入附加2μl/ml載體兩性電解質和0.01％二硫蘇糖醇的7M水化液150～200μl即為百合總蛋白質溶解液；

所述附加2μl/ml載體兩性電解質和0.01％二硫蘇糖醇的7M水化液制備方法為：取步驟(2)①制備的7M水化液1ml，用前加入2μl載體兩性電解質和0.01g二硫蘇糖醇即為附加2μl/ml載體兩性電解質和0.01％二硫蘇糖醇的7M水化液；

(3)百合總蛋白質溶解液的質量檢測

①將雙層玻璃板豎直夾在灌膠架上，且雙層玻璃板的上方朝上并使雙層玻璃板上方頂端面為水平，在雙層玻璃板之間灌入10％的分離膠，灌入的所述分離膠的上方頂面距離雙層玻璃板中的短玻璃板的上方頂端面2cm，在所述分離膠上方頂面用無水乙醇封面，待所述分離膠聚合且所述分離膠與無水乙醇分層后，倒去無水乙醇，然后在所述分離膠上方頂面灌入5％的濃縮膠，灌入的所述濃縮膠的上方頂面距離雙層玻璃板中的短玻璃板的上方頂端面1cm，插入點樣梳，待所述濃縮膠聚合凝固后，將此雙層玻璃板轉入蛋白質電泳槽中，并在蛋白質電泳槽中加入1×電泳緩沖液，拔去點樣梳，形成加樣孔，用注射器針尖將加樣孔內壁凸起的濃縮膠去掉使加樣孔內壁平滑；取步驟步(2)⑤獲得的百合總蛋白質溶解液4μl，加入2μl的溴酚藍指示劑混勻后加入加樣孔中，加樣完畢后，接通電源，起始時，用低電流5mA電泳或用低電壓50V電泳，待溴酚藍指示劑成一條線后，再加大電流為10mA電泳或加大電壓為150V電泳，待溴酚藍指示劑達到該雙層玻璃板底部邊緣時停止電泳；所述雙層玻璃板為寬度相等長度不等的兩塊玻璃板重疊放在一起且長玻璃板和短玻璃板一端對齊，長玻璃板和短玻璃板沒有對齊的一邊為雙層玻璃板的上方，其長玻璃板和短玻璃板的寬度均為10cm，長玻璃板的長度為8cm，短玻璃板的長度為7cm；

②停止電泳后，撬開雙層玻璃板，從雙層玻璃板中取出凝膠置于附加20％甲醇的考馬斯亮藍G250染液中染色，再用脫色液脫色后，置于校準型光密度儀上拍照并保存文件，膠圖條帶清晰且無拖尾，表明所提取出來的蛋白質質量好；繼續進行下一步百合總蛋白質的濃度測定；

(4)百合總蛋白質的濃度測定

取步驟(2)⑤獲得的百合總蛋白質溶解液采用Bradford法測定其百合總蛋白質的濃度，測定的百合總蛋白質濃度在3μg/μl以上，將步驟步(2)⑤獲得的百合總蛋白質溶解液置于-80℃保存；

(5)第一向等電聚焦

①上樣水化

用與步驟(2)⑤中相同的附加2μl/ml載體兩性電解質和0.01％二硫蘇糖醇的7M水化液將步驟(4)中于-80℃保存的百合總蛋白質溶解液稀釋至3μg/μl，取所稀釋的濃度為3μg/μl的百合總蛋白質溶解液300μl放入聚焦盤的槽內，做好標記，把預先解凍的固定化pH梯度膠條的保護膜去掉，然后將固定化pH梯度膠條沿聚焦盤的一端放入聚焦盤的槽內與聚焦盤槽內的百合總蛋白質溶解液結合，讓聚焦盤槽內的百合總蛋白質溶解液被固定化pH梯度膠條吸收2-3min，再在固定化pH梯度膠條上加入2～3ml礦物油水化14～16h；

②聚焦

將鹽橋用ddH2O潤濕后置于聚焦盤兩端；對好正、負極，蓋上蓋子，設置等電聚焦程序進行聚焦，所述的等電聚焦程序如下：

S1除鹽：250V，梯度為快速，2.5h；S2除鹽：1000V，梯度為快速，2.5h；S3升壓：9000V，梯度為線性，4.5h；S4聚焦：9000V，梯度為快速，65000v/h；S5保持：500V，梯度為快速，5h；

③第一次平衡：

將聚焦盤槽內固定化pH梯度膠條轉移至水化盤中的槽內，水化盤中的每個槽轉移一根經步驟(5)②聚焦的固定化pH梯度膠條，再向槽內加入5ml附加1％二硫蘇糖醇的膠條平衡液I，然后將水化盤置于搖床上40rpm搖晃15min即第一次平衡結束；

所述附加1％二硫蘇糖醇的膠條平衡液I的制備方法：首先配制膠條平衡緩沖液母液：容量瓶中加入36g尿素、2g十二烷基磺酸鈉、1.5mol/L pH8.8三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽25ml和20％的甘油20ml，用超純水定容至100ml得膠條平衡緩沖液母液，分裝至10ml的離心管中，每管10ml，-20℃冰箱保存備用；取一支10ml的膠條平衡緩沖母液，用前加入0.2g二硫蘇糖醇并充分混勻即為附加1％二硫蘇糖醇的膠條平衡液I；

④第二次平衡:

第一次平衡結束后，倒掉或吸掉水化盤中的膠條平衡緩沖液I，并用濾紙吸取多余的膠條平衡緩沖液I，將水化盤中的槽內的固定化pH梯度膠條取出豎直放在濾紙上，讓濾紙吸取多余的膠條平衡緩沖液I，以免損失蛋白或損壞凝膠表面，然后將固定化pH梯度膠條放回水化盤中的槽內，再加入5ml附加5％碘乙酰胺的膠條平衡緩沖液Ⅱ，繼續將水化盤在水平搖床上40rpm搖晃15min即第二次平衡結束，第二次平衡結束后，倒掉或吸掉水化盤中的附加5％碘乙酰胺的膠條平衡緩沖液Ⅱ，并用濾紙吸取多余的附加5％碘乙酰胺的膠條平衡緩沖液Ⅱ；

所述附加5％碘乙酰胺的膠條平衡緩沖液Ⅱ的制備：取步驟(5)③中所述的一支10ml的膠條平衡緩沖母液，用前加入0.25g碘乙酰胺并混勻即為附加5％碘乙酰胺的膠條平衡緩沖液Ⅱ；

(6)第二向SDS-PAGE電泳：

①制備聚丙烯酰胺凝膠

將一塊大雙層玻璃板豎直夾在灌膠架上，且大雙層玻璃板的上方朝上并使大雙層玻璃板上方頂端面為水平，量取10％的聚丙烯酰胺凝膠溶液注入所述大雙層玻璃板之間，注入的所述10％的聚丙烯酰胺凝膠溶液上方頂面距離大雙層玻璃板中的短玻璃板的上方頂端面1cm，在所述10％的聚丙烯酰胺凝膠溶液上方頂面用無水乙醇封面，聚合30min，當所述10％的聚丙烯酰胺凝膠溶液與無水乙醇分層后，表明10％的聚丙烯酰胺凝膠溶液已聚合即制成聚丙烯酰胺凝膠；所述大雙層玻璃板為寬度相等長度不等的兩塊玻璃板重疊放在一起且長玻璃板和短玻璃板一端對齊，長玻璃板和短玻璃板沒有對齊的一邊為大雙層玻璃板的上方，大雙層玻璃板中的長玻璃板和短玻璃板的寬度均為20cm，長玻璃板的長度為18cm，短玻璃板的長度為16cm；

所述10％的聚丙烯酰胺凝膠溶液的制備：取超純水15.9ml、30％聚丙烯酰胺13.3ml、1.5mol/L pH8.8三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽10ml、10％十二烷基磺酸鈉0.4ml、10％過硫酸氨0.4ml和四甲基乙二胺0.016ml混勻即為10％聚丙烯酰胺凝膠溶液；

所述30％聚丙烯酰胺的制備：稱取150g丙烯酰胺、4g甲叉雙丙烯酰胺，加超純水定容至500ml，濾紙過濾后所得濾液即為30％聚丙烯酰胺，裝入棕色瓶中4℃冰箱保存；

所述1.5mol/L pH8.8三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的制備：稱取90.75g的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽加入400ml超純水，再用1mol/L鹽酸調pH至8.8，加超純水定容至500ml，4℃冰箱保存；

所述10％十二烷基磺酸鈉的制備：稱取10g十二烷基磺酸鈉，用超純水定容至100ml，室溫保存；

所述10％過硫酸氨的制備：稱取0.1g過硫酸氨，用超純水定容至1ml，4℃冰箱保存；

②用濾紙吸去步驟(6)①中所述的大雙層玻璃板之間聚丙烯酰胺凝膠上方多余的無水乙醇后，將該大雙層玻璃板平放在桌面上，長玻璃板朝下，短玻璃板朝上，大雙層玻璃板的上方對著操作人員；

③在桌面上放置干的兩層濾紙，將在步驟(5)經第二次平衡后的水化盤中的固定化pH梯度膠條取出放在桌面上所述的兩層濾紙上，另一份兩層濾紙用超純水浸濕，擠去多余水分后，直接置于固定化pH梯度膠條上表面，吸干固定化pH梯度膠條上的礦物油及固定化pH梯度膠條上多余的百合總蛋白質溶解液；

④用鑷子夾住步驟(6)③經濾紙吸干礦物油及多余百合總蛋白質溶解液的固定化pH梯度膠條完全浸沒在1×電泳緩沖液中1～2s，所述1×電泳緩沖液與步驟(3)①中所述的1×電泳緩沖液相同，然后取出固定化pH梯度膠條放在步驟(6)②中平放在桌面上的所述大雙層玻璃板中長玻璃板長出的長玻璃板的上表面，且該固定化pH梯度膠條的支撐膜貼在長玻璃板的上表面，然后用鑷子將該固定化pH梯度膠條推入該大雙層玻璃板之間，且使該固定化pH梯度膠條位于該大雙層玻璃板之間聚丙烯酰胺凝膠的下面，并與該聚丙烯酰胺凝膠的膠面完全接觸，不要在所述固定化pH梯度膠條下方產生任何氣泡，在用鑷子推固定化pH梯度膠條時，推動該固定化pH梯度膠條背面的支撐膜，鑷子碰到該固定化pH梯度膠條的膠面；

⑤將步驟(6)④放有固定化pH梯度膠條的大雙層玻璃板豎直夾在灌膠架上，短玻璃板的平面對著操作人員，大雙層玻璃板的上方朝上，從大雙層玻璃板的上方向大雙層玻璃板之間加入低熔點瓊脂糖封膠液封面，放置5min，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固；

所述低熔點瓊脂糖封膠液的制備：在容量瓶中加入低熔點瓊脂糖0.5g、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽0.303g、甘氨酸1.44g，1ml 10％十二烷基磺酸鈉、100μl的1％溴酚藍，加超純水定容至100ml，80℃度水浴加熱溶解至澄清即為低熔點瓊脂糖封膠液，室溫保存；

⑥在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后，將步驟(6)⑤封有低熔點瓊脂糖封膠液的大雙層玻璃板移至電泳槽的槽內，向電泳槽槽內加入1×電泳緩沖液，所述1×電泳緩沖液與步驟(3)①中所述的1×電泳緩沖液相同，接通電源，起始時用低電流10mA電泳或用低電壓100V電泳,待大雙層玻璃板之間的百合總蛋白質溶解液完全從大雙層玻璃板之間的固定化pH梯度膠條中走出，看到溴酚藍指示劑呈一條直線后，再加大電流為20mA電泳或加大電壓為300V電泳，待溴酚藍指示劑達到該大雙層玻璃板底部邊緣時即停止電泳；電泳結束后，撬開大雙層玻璃板，取出大雙層玻璃板之間的聚丙烯酰胺凝膠，并切角以作記號；

(7)染色、脫色：

預先將200ml固定液加入塑料盒中，再將步驟(6)⑥取出的聚丙烯酰胺凝膠放入固定液中，盒上做標記，將塑料盒放在搖床上以40rpm的轉速搖動3h；然后倒掉塑料盒內的固定液，用超純水清洗塑料盒內的聚丙烯酰胺凝膠2次，加入附加20％甲醇的考馬斯亮藍G250染液200ml，在搖床上以40rpm的轉速搖動染色12h，棄去染色液，用超純水漂洗至沒有考馬斯亮藍G250殘渣；加入200ml脫色液，在搖床上以40rpm的轉速搖動脫色2d，所述附加20％甲醇的考馬斯亮藍G250染液與步驟(3)②中所述的附加20％甲醇的考馬斯亮藍G250染液相同，所述脫色液與步驟(3)②中所述的脫色液相同；

所述固定液的制備：量取乙醇400ml、乙酸400ml，用超純水定容至1L；

(8)圖像采集，將步驟(7)經脫色的聚丙烯酰胺凝膠置于校準型光密度儀上拍照并保存文件獲得百合總蛋白雙向電泳差異蛋白質圖譜。