[發明專利]一種誘導轉基因花生發狀根生物反應器產白藜蘆醇的方法

有效

• 申請號: 201610025963.6
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105463016B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 莊偉建;馬世偉;陳華;蔡鐵城;鄧燁;張沖
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/06;A01H6/54
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種誘導轉基因花生發狀根生物反應器產白藜蘆醇的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）克隆煙草根特異啟動子NtR12和花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS；

（2）煙草根特異啟動子NtR12驅動花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS表達載體pBI121-NtR12-AhRESS的構建；

（3）pBI121-NtR12-AhRESS經發根農桿菌介導轉化花生；

（4）轉pBI121-NtR12-AhRESS花生發狀根液體懸浮培養；

（5）醋酸鈉誘導花生發狀根使其白藜蘆醇含量增加；

（6）花生發狀根白藜蘆醇的提取及檢測；

（7）液體培養基中白藜蘆醇的提取及檢測；

其中，步驟（1）中煙草根特異啟動子NtR12的序列為SEQ ID No：1，花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS的序列為SEQ ID No：2；

步驟（2）具體方法為：

1）將煙草根特異啟動子NtR12連接至pMD18-T 載體中，得到pMD18-NtR12載體；

2）pBI121-NtR12-GUSA載體構建：將pBI121載體進行酶切，切除該載體上的GUSA基因，從pCAMBIA-1301載體中克隆GUSA基因連接至pBI121載體上，構建pBI121-GUSA；將pBI121-GUSA載體進行酶切反應，切除35S啟動子，將pMD18-NtR12載體進行酶切反應，將NtR12啟動子連接至pBI121-GUSA載體中，得到pBI121-NtR12-GUSA載體；

3）pBI121-NtR12-AhRESS載體的構建：將花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS基因連接到pBI121-NtR12-GUSA載體中，得到pBI121-NtR2-AhRESS載體；

步驟（3）中發根農桿菌介導的花生遺傳轉化外植體分別為葉片、子葉、上胚軸和下胚軸外植體；

步驟（4）中轉pBI121-NtR12-AhRESS花生發狀根液體懸浮培養所用培養基為1/2MS培養基，培養體系為：100 mL 1/2MS液體培養基，接種2-3根；培養條件為28℃，以120rpm的震蕩搖床中黑暗培養14d；

步驟（5）中醋酸鈉誘導的時間為花生發狀根培養至第11天時，醋酸鈉的濃度為20mM，誘導時間為24h；

步驟（6）中花生發狀根白藜蘆醇的提取采用浸提法，檢測用HPLC方法進行，其中色譜條件為：色譜柱 ODS，流動相乙腈：水=25:75，流速1.0 mL/min，檢測波長306 nm，柱溫25℃，進樣量10 μL；

步驟（7）中液體培養基中白藜蘆醇的提取采用以乙酸乙酯為萃取劑的萃取法獲得，檢測用HPLC方法進行，其中色譜條件為：色譜柱 ODS，流動相乙腈：水=25:75，流速1.0 mL/min，檢測波長306 nm，柱溫25℃，進樣量10 μL。