[發明專利]特異啟動子NtR2驅動AhRESS在花生發狀根系產白藜蘆醇的方法

有效

• 申請號: 201610025960.2
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105505990B
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發明（設計）人: 陳華;莊偉建;馬世偉;張沖;蔡鐵城;鄧燁
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/06
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明涉及特異啟動子NtR2驅動AhRESS在花生發狀根系產白藜蘆醇的方法，屬于植物基因工程領域。利用發根農桿菌介導將煙草根特異啟動子NTR2驅動花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS載體pBI121?NTR2?AhRESS遺傳轉化花生，獲得特異表達AhRESS的轉基因花生發狀根。利用有機溶劑浸提法提取轉基因花生發狀根中白藜蘆醇，經高效液相色譜（HPLC）測定，其白藜蘆醇含量最高為66.16μg/g（FW），是未轉基因發狀根中白藜蘆醇含量的3倍。本發明為利用煙草根特異啟動子驅動花生白藜蘆醇合酶基因AhRESS在花生發狀根中特異表達，進而生產白藜蘆醇提供了良好的基礎。

技術領域

本發明涉及特異啟動子NtR2驅動AhRESS在花生發狀根系產白藜蘆醇的方法，屬于分子生物學領域。

技術背景

白藜蘆醇（Resveratrol，簡稱Res），是一種重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤為豐富。它具有多種生物活性，是一種天然的抗氧化劑，可以降低血脂，抑制血小板凝結，抗癌，抗炎，抗輻射，抗衰老，防治心血管疾病等。它與紫杉醇都被譽為綠色抗癌藥物。但自然界中存在的白藜蘆醇的含量較少，利用植物基因工程技術高效生產白藜蘆醇是大量獲得白藜蘆醇的重要途徑。

白藜蘆醇廣泛存在于種子植物中，作為芪類次生代謝物，主要通過苯丙氨酸代謝途徑合成的。劉蕾等克隆了白藜蘆醇合酶cDNA，并將其轉化花生的下胚軸、胡蘿卜的下胚軸；同時，也把花生RESS轉化酵母。許玉芬等成功構建了花生白藜蘆醇合酶基因的酵母表達載體，并通過電穿孔法將其整合到畢赤酵母的染色體上；成功構建了由Ubi啟動子驅動的花生白藜蘆醇合酶基因單子葉植物表達載體，分別利用農桿菌介導和基因槍轉化法轉導甘蔗。黃國強等研究了白藜蘆醇合酶基因在花生根中的特異表達，研究結果表明：該基因的轉錄表達在根的韌皮部，其他組織中未見表達；酵母浸提液處理可使該基因的轉錄表達明顯增強。林榮華等以花生中的白藜蘆醇合酶基因為目的基因，構建了含目的基因的植物重組表達載體pB6RS，利用電穿孔法將pB6RS質粒直接導入根癌農桿菌LBA4404中，通過農桿菌介導將pB6RS轉化煙草（云煙85），得到了陽性植株。

由于白藜蘆醇的重要生理功能，近幾年，人們開始研究利用生物技術提高植物材料中白藜蘆醇的含量。Giovinazzo等研究者以35S啟動子調控白藜蘆醇合酶基因進行番茄遺傳轉化，測定轉基因番茄中的抗壞血酸鹽與谷胱甘肽還原酶的總體水平，結果表明：轉基因植物的抗氧化性較之野生型植物的抗氧化性有了顯著的提高。Hüsken等利用油菜種子特異表達啟動子驅動白藜蘆醇合酶基因表達，轉化油菜，同時，阻斷消耗白藜蘆醇合酶底物的另一條支路，檢測T₀代油菜種籽中的Res含量，發現以鮮重計其最高含量為361 μg/g，同時還獲得了品質改善且保健性提高的油菜種籽。但目前，通過根特異啟動子驅動白藜蘆醇合酶基因表達生產白藜蘆醇的研究未見報道。

發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）是一種革蘭氏陰性土壤細菌，它能夠侵染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物及裸子植物，誘導植物產生發狀根(毛狀根)。發狀根相對于正常的根，有很多優點。理論上，發狀根來源于一個植物細胞，不是嵌合體，所以其遺傳性狀穩定，繼代多次仍然具有原始發狀根的遺傳特性；發狀根能夠在無外源激素的培養基中自主生長，且生長速度快，易操作和調控，不受季節和地域限制；某些次生代謝產物在發狀根中含量比正常根高。因此，利用發狀根生產次生代謝產物是一條可靠和有效的途徑。