[發明專利]一種定量檢測含糖醛酸多糖的方法

有效

• 申請號: 201610025551.2
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105675779B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 宋爽;張豹;劉海曼;魯嬌嬌;劉斌;屈福杰;周大勇
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京律和信知識產權代理事務所(普通合伙)11446
• 代理人: 鮑曉芳,武玉琴

技術領域

本發明屬于糖醛酸多糖檢測技術領域，特別是涉及一種定量檢測含糖醛酸多糖的方法。

背景技術

結構中的重復二糖是由一個糖醛酸與一個氨基己糖或己糖組成的多糖廣泛存在于自然界中。如糖胺聚糖中的肝素、硫酸軟骨素、透明質酸等，都是由糖醛酸與氨基己糖連接而成的重復二糖片段構成。另外，在一些貝類等生物中還發現了含有糖醛酸與己糖連接而成的重復二糖片段的多糖，如鮑魚性腺多糖AGSP等。由于具有顯著的功能活性，一些含糖醛酸多糖被開發為藥品和保健品等。如硫酸軟骨素能有效預防關節炎，還具有抗癌、抗HIV、降血脂、抗凝血等功效，被開發為藥品、保健食品、化妝品等；肝素被開發為抗凝血藥物，在臨床上應用廣泛；透明質酸由于強持水性等性能，應用于臨床治療、診斷、化妝品基質以及營養保健品等。另外，還有一些食物中含糖醛酸多糖被證實具有增強免疫等生物活性，是重要的功效成分。因此，定量檢測這些含糖醛酸多糖是相關藥品、保健品、化妝品等產品質量控制的必要措施，也是對含這類多糖的食品質量評價的有力手段。

目前，對這些含糖醛酸多糖的定量檢測，化學顯色法最為常用，例如通過咔唑法測定糖醛酸含量從而間接測定這些含糖醛酸多糖，而含氨基糖的肝素、硫酸軟骨素、透明質酸等糖胺聚糖還可以通過Elson-Morgan法測定氨基糖含量來間接定量。但這些化學顯色法缺乏特異性，對于同時含有幾種這類多糖的樣品，只能測出它們的總量，而無法確定每一種多糖的含量。有文獻報道采用高效液相色譜-液質聯用技術對糖胺聚糖酶解后產生的二糖進行定量，從而對各種糖胺聚糖進行定量，但糖胺聚糖酶的降解酶價格都十分昂貴，而含糖醛酸-己糖二糖片段多糖還沒有商品化的降解酶，因此該方法難以廣泛應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種定量檢測含糖醛酸多糖的方法。

本發明實現上述目的的技術方案如下：一種定量檢測含糖醛酸多糖的方法，包括以下步驟：

步驟1，將已知的多糖配制成系列濃度的標準多糖溶液；

步驟2，提取待測樣品中的多糖并配置成待測樣品溶液；

步驟3，將標準溶液和待測樣品溶液中的多糖水解，得到水解殘余物；

步驟4，步驟3所得殘余物用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，制備糖的衍生物；

步驟5，利用高效液相色譜儀和三重四極桿串聯線性離子阱質譜儀對糖的衍生物進行分析；

步驟6，依據標準多糖混合溶液的MRM色譜圖及待測樣品溶液的MRM色譜圖，利用色譜峰保留時間和監測離子豐度比確定待測樣品為何種含糖醛酸多糖；

步驟7，根據高效液相色譜-質譜獲得的標準多糖二糖衍生物的MRM色譜圖，制定色譜峰面積與多糖濃度的標準曲線，利用待測樣品的峰面積計算待測樣品中含糖醛酸多糖的含量。

本發明如上所述的定量檢測含糖醛酸多糖的方法，優選地，步驟1和步驟2中制備的標準多糖溶液、待測樣品溶液中含有三氟乙酸；在步驟3的具體過程為：標準品溶液、樣品溶液密封，在105℃水解3h；酸水解液使用冷凍離心濃縮除去溶劑，再加入0.5mL甲醇，使用冷凍離心濃縮除去溶劑，以上操作重復三次，達到除酸目的。

本發明如上所述的定量檢測含糖醛酸多糖的方法，優選地，步驟4的具體過程為：加入300μL的氨水溶解殘渣，再加入300μL 0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，密封，70℃水浴30min，加入1mL甲醇，真空冷凍離心減壓除去溶劑，重復三次；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震蕩后除去氯仿，重復萃取三次，水層作為供試液。

本發明如上所述的定量檢測含糖醛酸多糖的方法，優選地，步驟5的具體過程為：以乙腈/20mM乙酸銨水溶液為流動相，使用配備反相C18色譜柱的高效液相色譜-質譜聯用分析，離子源ESI源；正離子模式，監測不同種類多糖二糖片段衍生物的特征離子對。

本發明如上所述的定量檢測含糖醛酸多糖的方法，優選地，所述特征離子對如下：687.30/511.20、686.30/492.10、686.30/525.20、686.30/510.12、687.30/373.00、687.30/187.00、686.30/175.00、686.30/187.00、687.30/175.00、686.30/373.00。

本發明如上所述的定量檢測含糖醛酸多糖的方法，優選地，所述含糖醛酸多糖為具有一個糖醛酸與一個氨基己糖或己糖組成的重復二糖片段的多糖。