[發明專利]用于檢測人類TP53基因5種突變的探針、引物及試劑盒

有效

• 申請號: 201610025123.X
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105463114B
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 朱峰;楊惠娟;段衛濤;趙平鋒
• 申請（專利權）人: 武漢海吉力生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

本發明公開了用于檢測人類TP53基因5種突變的探針、引物及試劑盒，其中TM1～TM5的5組引物和探針，每組中突變引物能與TP53基因保守序列結合，突變ARMS引物能與其相應的突變序列特異性結合，擴增突變序列；檢測探針能夠與擴增片段結合，阻斷探針能與突變位點對應的野生型序列特異性結合，抑制野生型非特異性擴增。本發明采用特異性突變引物和探針阻斷技術，可準確檢測TP53基因5種突變類型；建立的實時熒光PCR擴增反應體系的試劑盒方便對TP53基因突變的快速檢測，操作簡單，結果易讀；檢測方法靈敏度高，50拷貝突變能穩定檢出；特異性好，20ng野生型基因組DNA無非特異性擴增，檢測能力高達1％。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種用于檢測人類TP53基因5種突變的探針、引物及試劑盒。

背景技術

野生型TP53基因是一種抑癌基因，其編碼的p53蛋白能修復已損傷細胞或除去嚴重損傷的細胞以免除這些細胞對機體的危害。TP53基因突變與人類50％的腫瘤有關，目前發現的就有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌、腦瘤、淋巴細胞腫瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等，且在不同腫瘤中TP53等位基因突變存在差異。

人類腫瘤中TP53突變主要在高度保守區內，大部分為錯義突變，其中以175、245、248、249、273、283等密碼子位點突變最高，這可能是特定癌癥發生發展的一個主要因素。研究表明，野生型p53基因能夠抑制多藥耐藥蛋白基因轉錄，突變型TP53基因則可增強多藥耐藥基因表達，與腫瘤細胞對鉑類化療藥的耐藥性相關，但不影響紫杉醇類藥的敏感性。因此一般認為TP53基因突變檢測可用于指導臨床腫瘤患者化療的個體化用藥。

目前檢測基因突變的方法主要有測序法、溶解曲線法和液相芯片法。直接測序的靈敏度低，檢測靈敏度只有20-30％；實驗操作復雜，檢測效率低、樣品易污染，通常要1-2天才可出檢測結果。特別是對于小樣本的檢測，直接測序的方法幾乎無法實現其準確檢測，會導致大量漏檢及假陰性的發生。而不管是染料溶解曲線還是探針溶解曲線法，都無法有效區分同一位點的多種突變類型。液相芯片法操作過程復雜，且容易污染，假陽性率高。

發明內容

為了解決現有的TP53基因突變檢測方法檢測效率低、樣品易污染、檢測時間長、準確性差、區分度困難等問題，本發明提供了用于檢測人類TP53基因5種突變的引物和探針。本發明還提供了含有該引物和探針的試劑盒，實現不限場地的快速準確檢測。

本發明提供的用于檢測人類TP53基因5種突變的引物和探針，其核苷酸序列如下：

TM1：R175H突變

突變上游ARMS引物TM1-F：SEQ ID NO:2，

突變下游引物TW1-R：SEQ ID NO:1，

檢測探針TW1-P：SEQ ID NO:3，

阻斷探針TW1-B：SEQ ID NO:4；

TM2：R248W突變

突變上游引物TW2-F：SEQ ID NO:5，

突變下游ARMS引物TM2-R：SEQ ID NO:6，

檢測探針TW2-P：SEQ ID NO:8，

阻斷探針TW2-B：SEQ ID NO:9；

TM3：R248Q突變

突變上游引物TW2-F：SEQ ID NO:5，

突變下游ARMS引物TM3-R：SEQ ID NO:7，

檢測探針TW2-P：SEQ ID NO:8，