[發明專利]基于6B瓊脂糖微球的鎳金屬層析介質的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201610024967.2
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105498715A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 董垚;鄭忠亮;夏其林
• 申請（專利權）人: 武漢菲恩生物科技有限公司
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/30;C07K1/22;B01D15/20
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

技術領域

本發明屬于蛋白質純化技術領域，具體涉及一種基于6B瓊脂糖微球的鎳金屬層析介質的制備方法及其應用。

背景技術

現代生物醫藥產業的高速發展，要求生物材料的性能逐步提高。以瓊脂糖制備的親和層析介質廣泛運用于蛋白質的分離工程中，介質性能直接決定了分離純化的效率。

瓊脂糖作為一種富含有羥基，具有良好的生物可溶性，是分離純化過程中，運用最廣泛的基質合成材料。但是，由于普通的瓊脂糖微球硬度較低，在高壓的條件下容易產生形變，減低微球間空隙的大小，直接導致純化介質的流速降低；而一味的提高流速會直接導致瓊脂糖微球的破裂，影響純化效果。基于此種局限性，通常會對瓊脂糖微球進行交聯和改性?，F有報道中，常見的交聯劑為含有環氧、Cl和Br等活性較高官能團的有機物。較早的報道如PorathJC(1975,journalofchromatography10349-62)等利用堿性條件下，環氧氯丙烷與瓊脂糖微球進行反應，制備擁有一定機械強度的微球。PernemalmP等在專利EP0203049A1中報道，通過一種分步交聯的方法，實現瓊脂糖微球的高度交聯，即利用含有多個環氧官能團的有機物如1,4-丁二醇縮水甘油醚、三環氧丙基異氰尿酸酯等，利用這些有機物較長的分子鏈，先對瓊脂糖的空間結構進行穩定，而后利用環氧氯丙烷對瓊脂糖微球的結構進行加強，獲得擁有較高強度的微球。

與此同時，為了獲得較高純度的目標蛋白，減少分離步驟、降低生產成本，需要利用特殊手段對瓊脂糖進行改性。鎳金屬親和層析就是利用含有六個組氨酸標簽的重組蛋白，能夠特異性結合于金屬鎳上。正是利用這一特性，我們能夠制備出含有鎳的親和純化介質。PorathJ等在1975年首次報道了利用金屬離子能夠與蛋白之間發生親和作用，并成功的利用這一特性實現了對目標蛋白的分離和純化。

然而，由于天然瓊脂糖中含有大量的含硫的物質，且難以處理干凈。使得純化過程中純化介質帶有電荷效應，對樣品中的雜蛋白產生吸附作用，影響洗脫效果。因此，需要克服瓊脂糖微球的電荷效應這種理化性質，提高蛋白質純化效果。

發明內容

本發明的目的是克服現有瓊脂糖微球中交聯步驟繁瑣，交聯后介質偶聯配基密度較低以及瓊脂糖理化性質影響純化效果的問題。

為此，本發明提供了一種基于6B瓊脂糖微球的鎳金屬層析介質的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)將環氧氯丙烷、2M的氫氧化鈉和6B瓊脂糖微球按體積比0.1～0.5:0.5～0.9:1進行混合，在反應溫度為25～70℃的條件下，反應3～6小時制得活化的瓊脂糖微球。

2)將1M的氫氧化鈉、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步驟1)制得的活化的瓊脂糖微球按體積比0.3～0.9:1:1混合，在反應溫度為25～37℃的條件下，反應5～10小時，得到葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球。

3)將環氧氯丙烷、2M的氫氧化鈉和步驟2)制得的葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球按體積比0.1～0.5:0.4～0.8:1進行混合，在反應溫度為25～70℃的條件下，反應3～6小時，制得活化的葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球介質。

4)步驟3)反應結束后，立即用1mM的鹽酸進行中和，然后用蒸餾水沖洗活化的葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球介質。

5)將步驟4)處理后的活化的葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球介質與1M的碳酸鈉溶液以體積比1:1或1:2混合后，加入L-天門冬氨酸至終濃度為0.1M～0.3M，在50～60℃下反應5～10小時后，用蒸餾水沖洗活化的葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球介質至中性。

6)將步驟5)處理后的活化的葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球介質與0.1M的碳酸鈉溶液按體積比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至終濃度為0.3M～0.6M，在25～30℃下反應5～12小時后，用蒸餾水沖洗介質至中性。

7)將步驟6)處理后的活化的葡聚糖修飾的6B瓊脂糖微球介質與100mM的硫酸鎳溶液等體積混合室溫反應2～3小時后，用蒸餾水沖洗介質至介質顏色不再變化，流出液中無鎳離子為止，得到鎳金屬層析介質。

上述步驟1)～3)和步驟5)～6)中的反應均在搖床上震蕩反應。

上述步驟2)中的葡聚糖分子量為4000。

本發明中，優選的一種基于6B瓊脂糖微球的鎳金屬層析介質的制備方法，包括如下步驟：

1)將環氧氯丙烷、2M的氫氧化鈉和6B瓊脂糖微球按體積比0.2:0.8:1進行混合，在反應溫度為40℃的條件下，反應3小時制得活化的瓊脂糖微球。