[發(fā)明專利]一種分層包裝帶指示劑的直接實時定量熒光PCR方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610024292.1
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105420416B
• 公開（公告）日: 2020-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王海濱;王棽;周其玲;馮小霞
• 申請（專利權(quán)）人: 北京納捷診斷試劑有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京東巖躍揚(yáng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11559
• 代理人: 葉平;李玉秋

本發(fā)明提供了一種分層包裝帶指示劑的直接實時定量熒光PCR方法，將熱啟動DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液各自分層包裝在PCR擴(kuò)增管內(nèi)，使用時加入核酸裂解液和待測樣品，進(jìn)行實時定量熒光PCR。利用本發(fā)明可檢測出低至20IU/ml的病毒量，優(yōu)選的檢測范圍為30～2×10⁹IU/ml。檢測結(jié)果不受操作人員專業(yè)水平和實驗室實驗條件的限制，具有操作簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種分層包裝帶指示劑的直接實時定量熒光PCR方法。

背景技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制性質(zhì)而設(shè)計的體外快速擴(kuò)增特定DNA序列的技術(shù)。PCR反應(yīng)體系主要由核酸引物、4種dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反應(yīng)緩沖液體系組成。自美國Cetus公司人類遺傳室KaryMullis及其同事于1985年發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以來，PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)就被快速開發(fā)出來，并在多種核酸檢測中得到了廣泛的運(yùn)用。尤其是病毒或其他病原體的檢測，當(dāng)知道待檢病原某一特定基因片段時，即可利用特異性的引物對樣品中微量的目標(biāo)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使其達(dá)到檢測量，通過適當(dāng)?shù)臋z測手段進(jìn)行檢測，即可確定病原體的存在與否。

實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用DNA擴(kuò)增過程中熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通的PCR相比，實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，實現(xiàn)了PCR的定量分析。

目前，無論臨床實驗室檢測還是疫情處理，傳染病病原的核酸熒光PCR檢測技術(shù)，均需經(jīng)過核酸提取或純化過程，該過程需要專門的實驗室環(huán)境和相應(yīng)設(shè)備，實驗操作人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)；另外，這樣的操作增加了實驗操作步驟，并延長了檢測時間，增加了污染的幾率。同時，DNA聚合酶與PCR反應(yīng)試劑的混合接觸，也會導(dǎo)致其活性的降低，從而降低實時熒光定量PCR的敏感性。

因此，需要找到一種試劑穩(wěn)定性好、操作簡便、定量準(zhǔn)確的實時定量熒光PCR方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對實時定量熒光PCR過程中核酸提取操作復(fù)雜，容易產(chǎn)生污染，且PCR靈敏度低的缺點(diǎn)，提供了一種試劑穩(wěn)定性好、操作簡便、定量準(zhǔn)確的直接實時定量熒光PCR方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種分層包裝帶指示劑的直接實時定量熒光PCR方法，將熱啟動DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液各自分層包裝在PCR擴(kuò)增管內(nèi)，使用時加入核酸裂解液和待測樣品，進(jìn)行實時定量熒光PCR。

本發(fā)明技術(shù)方案的具體實施步驟為：

1)用熔點(diǎn)為50℃～55℃的石蠟油混合物包被熱啟動Taq DNA聚合酶，并置于PCR擴(kuò)增管管底；

2)混合引物、探針、Tris堿、氯化鎂、氯化鉀、石綠和dNTP，制得熒光PCR擴(kuò)增試劑于石蠟油混合物上層；

3)用熔點(diǎn)為40℃～45℃的石蠟油封閉所述熒光PCR擴(kuò)增試劑于步驟1)的PCR擴(kuò)增管內(nèi)；

4)石蠟油冷凝后，加入核酸裂解試劑和待測樣品；

5)檢測樣品。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，發(fā)明人采用分層包裝的方法將熱啟動DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液分別用石蠟油混合物包被，使二者彼此分開而不混合，以此保證聚合酶的活性，防止聚合酶因直接與PCR擴(kuò)增反應(yīng)液混合而導(dǎo)致的活性降低。

作為優(yōu)選，所述熱啟動DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶。

作為優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括引物、探針、Tris堿、氯化鎂、氯化鉀和dNTP。