[發明專利]農藥西維因分子印跡仿生快速檢測試紙條的制備及其應用

有效

• 申請號: 201610023795.7
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105572349B
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發明（設計）人: 張燦;崔涵雨;韓玉鳳;蔡健榮
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/53;G01N21/78
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技術領域

本發明屬于分子印跡技術，特別涉及基于濾紙為固相載體制備農藥西維因分子印跡仿生快速檢測試紙條及其應用。

背景技術

西維因，又稱甲萘威、胺甲萘，是世界上第一個商品化且大量使用的高效低毒氨基甲酸酯類殺蟲劑，廣泛用于防治麥、稻、棉、蔬菜、果樹等作物的害蟲、畜禽外寄生蟲等，與有機磷農藥混合使用對多種農業害蟲具有明顯的增效作用。西維因含有一個N-甲基基團,為白色晶體,難溶于水,易溶于有機溶劑如丙酮、二氯甲烷等,在堿性和高溫條件下很易被水解。西維因具有中等毒性，可以經過皮膚、消化系統、呼吸系統進入生物體，進入生物體的西維因通過抑制膽堿酯酶的活性，使乙酰膽堿在組織中蓄積，干擾生物體正常的分泌系統，因此具有致畸、致癌、致突變的作用。目前,西維因殘留的檢測方法主要包括氣相色譜-質譜聯用法、固相萃取法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等。儀器分析檢測技術對樣品的前處理以及檢測條件要求較高，耗時較長，對操作人員要求較高。食品流通從市場到消費者速度快，范圍廣，為及時確保消費者的食品安全，研究開發快速有效的檢測方法勢在必行。

分子印跡技術主要是將模板分子與功能單體通過共價鍵或非共價鍵作用,加入交聯劑,在引發劑及溶劑的作用下通過熱引發或光引發實現聚合反應。洗去模板分子后的分子印跡聚合物中留有在空間大小和形狀以及化學作用等方面都與模板分子相匹配的孔穴,可以特異性與模板分子結合。由于分子印跡具有構像預定性、特異識別性和廣泛的適用性，在許多領域得到深入的研究和開發。近些年，該技術已被廣泛用于色譜分離、生物傳感器、抗體和受體模擬等諸多領域，成為一個化學和生物學交叉的新興領域。

以生物抗體為識別元件的免疫分析法中尤以酶聯免疫法(ELISA)研究最多，廣泛用于各種農獸藥小分子危害殘留物的定性和定量檢測。因ELISA具有快速、簡便等優點，目前市場上已有商業化使用的酶聯免疫試劑盒及試紙條。試紙條與試劑盒相比前者以定性為主，后者以定量為主，但前者更易攜帶、更快檢測，在現場檢測時能快速判定是否含有某種物質，含量是否超過標準。目前免疫分析法所面臨的主要問題是生物抗體的制備(特別是小分子化合物的生物抗體)，生物抗體的制備周期長、操作繁復，且制得的抗體特異性難以保障，特別是農藥等小分子化合物，制備質量穩定的生物抗體具有一定難度。另外生物抗體對外界環境較為敏感，易失去活性，易造成假陽性結果使其應用受限，研究人員不斷對其進行改進，目前有研究報道將分子印跡作為人工抗體替代生物抗體應用于ELISA，稱之為仿生酶聯免疫(BELISA)。分子印跡聚合物表現出對目標物的特異性吸附與天然抗體對抗原的高度親和性和專一性相類似，因此將印跡聚合物替代生物抗體用于小分子物質的免疫分析是完全可實現的。

發明內容

本發明的目的是填補當前尚未有的西維因分子印跡仿生快速檢測試紙條的空白。提供一種以濾紙為固相載體，制備過程簡單，制備產品理化性能好、檢測靈敏度較高的快速檢測試紙條的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

采用Whatman NO.5濾紙作為固相載體，通過在其紙纖維表面硅烷化后引入功能雙鍵。將西維因、甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)溶于氯仿，加入預先硅烷化的濾紙載體，水浴熱引發，在濾紙纖維素表面制備西維因分子印跡聚合物。模擬生物抗體與抗原和酶標抗原競爭性免疫結合反應機理，利用西維因酶標抗原作為反應標記物與西維因競爭結合濾紙上西維因分子印跡聚合物的印跡孔穴位點(仿生抗體)，底物顯色后通過判斷檢測紙片上顏色變化從而定性檢測樣本中西維因含量。

農藥西維因分子印跡仿生快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：

(1)固相載體的預處理：

Whatman NO.5濾紙于真空干燥箱預干燥以除去水分，浸泡于含γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷γ-MAPS的乙醇溶液中，干燥箱固定后切割成一定直徑的圓形紙片；

(2)西維因分子印跡仿生試紙條的制備：

將模板分子西維因、功能單體MAA、交聯劑EGDMA、引發劑溶于氯仿，加入經步驟(1)預先處理過的紙片，脫氣后，水浴中進行熱聚合反應，得到西維因分子印跡仿生試紙條；

(3)模板分子的去除：

用甲醇-醋酸混合溶液索氏提取模板分子，反復操作，直到檢測不出模板分子為止，真空干燥至恒重。

步驟(1)中，所述乙醇溶液中γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷的質量百分濃度為0.5-0.6％，所述乙醇溶液的濃度為80％。