[發(fā)明專利]新的綜合性耳聾相關基因突變檢測體系及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610023575.4
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105543370B
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發(fā)明（設計）人: 馮永;劉德遠;劉亞蘭;梅凌云;賀楚峰;劉暢;陳紅勝;姜正文
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫(yī)院;天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 夏海天

本發(fā)明公開了一種新的綜合性耳聾相關基因突變檢測體系，針對目前已知的6個與Waardenburg綜合征相關的基因，選取的59個檢測位點組成耳聾基因突變檢測體系，采用連接酶連接反應的高特異性對目的區(qū)域進行雜交、連接，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列以及通過連接酶加接反應獲得位點對應的不同長度連接產(chǎn)物，利用標記熒光的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增。本發(fā)明的優(yōu)越性在于通過對現(xiàn)有多重核酸分子擴增技術加以改進，設計特定的檢測探針，設置特定的檢測體系組分和反應條件，以同時對6個已知與Waardenburg綜合征有關的基因上的共59個位點進行快速拷貝數(shù)變異檢測，檢測可在一個工作日內(nèi)完成，最低僅需200納克的DNA即可得到準確的檢測結(jié)果。

技術領域

本發(fā)明涉及生物學研究和Waardenburg綜合征的分子檢測領域，具體涉及一種新的綜合性耳聾相關基因突變檢測體系及試劑盒。

背景技術

Waardenburg綜合征(Waardenburg Syndrome，WS)，是最常見的染色體顯性和隱性遺傳性綜合征型耳聾，又稱聽力-色素綜合征，主要的臨床特征為感音神經(jīng)性耳聾以及虹膜、頭發(fā)和皮膚的色素分布異常，根據(jù)不同的伴隨表型又分為4型。WS的人群發(fā)病率為1/212000，但由于該綜合征的不完全外顯率達20％，故推測實際人群發(fā)病率為1/42000，占先天性耳聾的2～5％，聾啞人群中發(fā)病率為0.9～2.8％。據(jù)目前研究表明，WS具有高度的遺傳異質(zhì)性，已證實與WS有關的基因有6個，分別為：MITF、PAX3、SOX10、SNAI2、ENDRB、EDN3，已報道WS基因突變位點有近278個。關于WS的拷貝數(shù)變異(Copy number variation，CNV)國外已有報道，Milunsky、Wildhardt G利用多重連接依賴探針擴增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)分別發(fā)現(xiàn)了WS相關基因上PAX3和MITF的多個CNV，提高了WS的突變檢出率，并一致認為，相關基因的CNV檢測應作為一種常規(guī)檢測方法應用到WS的分子診斷檢測中。

目前針對目標基因CNV的檢測方法有以下幾種：FISH、多重可擴增探針雜交(Multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH).、多重連接依賴探針擴增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)、短熒光片段多重定量PCR(Quantitative multiplex PCR ofshort fluorescent fragments，QMPSF)、CGH Array。除FISH和CGH外，以上這些方法都以PCR為基礎，適用于對特定目標基因進行定量分析。在篩查和診斷遺傳性疾病上,這些方法存在各自的優(yōu)缺點。

基于多重可擴增探針雜交的MAPH方法是Armour等人于2000年報導的一種用于基因拷貝數(shù)變異的定量分析方法。該方法把特定的PCR產(chǎn)物與固定在尼龍膜上基因組DNA進行雜交,通過PCR及電泳技術檢測雜交回收探針的量，來實現(xiàn)基因組中相應目的DNA片段拷貝數(shù)的檢測。相比較下面要介紹的MLPA技術，MAPH與MLPA均可以同時檢測40多個目的序列,結(jié)果的準確度、精度高。但是，該方法的步驟繁瑣，需要先固定樣本DNA及洗脫未反應的探針，難以滿足臨床診斷的需要。

MLPA是Schouten等人于2002年首先報導的,該方法可以檢測出DNA序列的缺失和重復。該方法特異、高效，一次反應可以同時檢測40多個目的序列拷貝數(shù)的改變，但存在以下幾方面不足:1、檢測平臺開放式，容易造成污染；2、其設計的長探針不能通過化學方法合成,需要通過M13載體克隆的方法獲得；3、雜交步驟耗時過長(16小時)。這些都是MLPA不可避免的局限性。