[發(fā)明專利]低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610023362.1
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105483101B
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 周峻沛;張蕊;黃遵錫;宋志鳳;唐湘華;李俊俊;吳倩
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

本發(fā)明公開了一種低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β?N?乙酰葡糖胺酶，β?N?乙酰葡糖胺酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；制備方法包括：包含β?N?乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重組載體，重組載體為pEasy?E2?jb10nagA，將乙酰葡糖胺酶基因插入到表達載體中，使核苷酸序列與表達調(diào)控序列相連接，用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導重組β?N?乙酰葡糖胺酶JB10NagA表達；回收所表達的β?N?乙酰葡糖胺酶JB10NagA。本發(fā)明的酶可催化水解幾丁寡糖并與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì)。本發(fā)明的β?N?乙酰葡糖胺酶可應用于海產(chǎn)品加工、生物燃料、醫(yī)學、功能性食品等行業(yè)。

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶。

背景技術

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-胺基葡萄糖單體通過β-1,4鍵形成的多聚糖，廣泛存在于真菌、昆蟲細胞壁以及甲殼類動物外骨骼中，其蘊藏量僅次于纖維素，居天然生物多聚高分子的第二位，但大量的幾丁質(zhì)并未得到有效利用，每年超過80000噸的幾丁質(zhì)被廢棄(Patilet al.,Enzyme and Microbial Technology,2000,26:473–483)。β-N-乙酰葡糖胺酶屬于幾丁質(zhì)降解酶系中的一種水解酶，可催化幾丁寡糖降解為N-乙酰-D-胺基葡萄糖單體，在幾丁質(zhì)的徹底水解中起到關鍵性作用。根據(jù)氨基酸序列同源性，β-N-乙酰葡糖胺酶主要歸類于糖苷水解酶第3、20、73和84家族(Cantarel et al.,Nucleic acids research,2009,37:D233–D238)。β-N-乙酰葡糖胺酶被廣泛應用于功能性食品、保健品、化妝品、制藥、飼料添加劑、生物燃料及生物防治等領域(Yang et al.,Journal of Agricultural and FoodChemistry,2014,62:5181–5190)。因為大多數(shù)β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解產(chǎn)物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制，所以耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶可更有效地使幾丁質(zhì)徹底水解；另外，β-N-乙酰葡糖胺酶可解除幾丁寡糖對內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的抑制作用，從而與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生協(xié)同作用(Yang et al.,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181–5190)。耐鹽酶在高濃度NaCl下仍然具有催化活性，可應用于高鹽食品和海產(chǎn)品加工及其它高鹽環(huán)境生物技術領域，在高鹽環(huán)境下加工食品還可以防止微生物的污染并節(jié)省滅菌等所消耗的能源(Madern et al.Extremophiles,2000,4:91–98)。低溫酶在低溫環(huán)境中具有較高的酶活，相對于中溫或高溫酶有其特有的應用優(yōu)勢，如水產(chǎn)生境常常為10–25℃；將中溫或者高溫加工的過程轉(zhuǎn)為低溫加工過程還可起到降低能耗的作用(Cavicchioli et al.Microbial Biotechnology,2011,4:449–460)。低溫耐鹽的β-N-乙酰葡糖胺酶在降解海洋生物來源的幾丁質(zhì)方面具有獨特的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，旨在解決大量的幾丁質(zhì)并未得到有效利用的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步，所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶本總共含666個氨基酸，理論分子量為70.94kDa。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制備方法，所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制備方法包括以下步驟：

包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重組載體，重組載體為pEasy-E2-jb10nagA，將乙酰葡糖胺酶基因插入到表達載體中，使核苷酸序列與表達調(diào)控序列相連接，用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；