[發明專利]一種L-草銨膦的酶-化學催化去消旋化制備方法

在審

• 申請號: 201610022960.7
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105567780A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 夏仕文;方國蘭;熊文娟;韋燕嬋
• 申請（專利權）人: 重慶惠健生物科技有限公司
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P13/00
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅;李金蓉

技術領域

本發明涉及L-草銨膦的酶-化學催化去消旋化制備方法，屬于酶法制備手性農藥技術領域。

背景技術

德國赫斯特（Hoechst）公司開發的草銨膦（Glufosinate）是一種谷氨酰胺合成酶（GS）抑制劑，能抑制GS所有已知的形式，導致植物體內氮代謝紊亂、氨的過量積累、葉綠體解體，從而使光合作用受抑，最終導致植物死亡。草銨膦具有很強的除草活性，幾乎能有效防除各種供試雜草，對農作物安全，活性高，殺草譜廣，藥害小，是目前轉基因抗性作物理想的除草劑。草銨膦同時也是一種優良的殺菌劑。

草銨膦含一個手性中心，其L-對映體的除草活性是消旋體的2倍，不易產生抗藥性，產品壽命周期比消旋體更長。如果草銨膦產品能以L-構型的純光學異構體形式使用，可使草銨膦的使用量降低50%，這對于提高原子經濟性、降低使用成本、減輕環境壓力都具有十分重要的意義。

L-草銨膦的制備方法主要包括化學法和生物法。

（一）化學法。赫斯特公司（US5767309）采用不對稱轉換法，以奎寧為手性拆分劑拆分DL-草銨膦制備L-草銨膦。該方法使用昂貴的手性拆分劑，經歷成鹽、誘導結晶、解鹽、重結晶等復雜步驟。文獻報道了大量的L-草銨膦化學不對稱合成法（毛明珍等，農藥，2014，53（6）：391-393）。化學不對稱合成法采用價格昂貴的手性源、手性助劑或手性催化劑，通常步驟冗長，合成路線復雜，反應條件苛刻，產品收率和光學純度低，生產成本高，不適合L-草銨膦的工業化生產。

（二）生物法。生物法包括生物不對稱合成法和生物拆分法（樓億圓等，現代農藥，2009，8（3）：1-10）。生物不對稱合成法主要包括氨基酸脫氫酶法和轉氨酶法。氨基酸脫氫酶法以2-羰基-4-（羥基甲基膦酰基）丁酸為原料，采用谷氨酸脫氫酶/葡萄糖脫氫酶體系制備L-草銨膦，收率僅為25%，ee值為89.2%（FangJMetal.JChemSoc,PerkinTransI,1995：967-978.）。該方法中不僅谷氨酸脫氫酶的利用效率非常低，產物收率低，而且輔酶NADH需再生，難以在工業化生產中應用。轉氨酶法以2-羰基-4-（羥基甲基膦酰基）丁酸為氨受體，L-谷氨酸或L-天冬氨酸為氨供體，通過轉氨化反應制備L-草銨膦，轉化率達到75%，ee>99%（US5153355）。由于轉氨化是一個可逆反應，存在兩個L-氨基酸和兩個α-酮酸的反應平衡，L-草銨膦不僅收率低，而且也增加了分離難度。生物拆分法主要包括以DL-2-氨基-4-（羥基甲基膦酰基）丁酰胺為原料的L-酰胺酶拆分法，以N-乙酰（苯乙酰）-DL-草銨膦為原料的酰化酶拆分法，以2-氨基-4-（羥基甲基磷酰基）丁腈為原料的腈水解酶拆分法（CN103275896A）等。生物拆分法的理論收率僅為50%。通常情況下，生物拆分法需要以衍生的DL-草銨膦為原料，涉及無效對映體的化學消旋和循環拆分。

相比于化學法，生物法具有立體選擇性嚴格、反應條件溫和、收率高及產物易分離純化的優點，是實現L-草銨膦工業化生產最具潛力的方法。開發一種簡捷、高效、綠色的生物制備方法將是今后生產L-草銨膦的重要突破口和發展方向。

發明內容

鑒于此，本發明的目的是提供一種L-草銨膦的酶-化學催化去消旋化制備方法。采用“一鍋煮”反應方式，以未經衍生的DL-草銨膦為原料，利用固定化D-氨基酸氧化酶對映選擇性催化DL-草銨膦中的D-對映體氧化脫氫為2-亞氨基-4-（羥基甲基膦酰基）丁酸，L-草銨膦完全保留。利用鈀碳-甲酸銨化學催化氫轉移體系將2-亞氨基-4-（羥基甲基膦酰基）丁酸原位還原為DL-草銨膦，通過生物氧化-化學還原循環實現DL-草銨膦的去消旋化，反應過程中形成的過氧化氫利用過氧化氫酶原位分解去除，從而以高的收率和高的光學純度制備L-草銨膦。

技術路線如下：

本發明包括去消旋化步驟和L-草銨膦分離步驟，具體方法步驟如下：

1）去消旋化反應，在1mol/L的甲酸銨溶液（pH6.5）中加入DL-草銨膦，攪拌溶解，配制的溶液中DL-草銨膦的濃度為10~20%（w/v）。然后加入固定化D-氨基酸氧化酶、過氧化氫酶和鈀碳，連續通入氧氣，30℃下攪拌反應直至D-對映體反應完全；