[發明專利]動物糞便宏基因組來源的多功能木聚糖降解酶、其編碼基因及其制備方法

有效

• 申請號: 201610020430.9
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN105602920B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 許波;戴利銘;黃遵錫;李俊俊;唐湘華;周峻沛;楊云娟;丁俊美
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N9/24;C12N15/56
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種動物糞便宏基因組來源的多功能 木聚糖降解酶、其編碼基因及其制備方法。

背景技術

木聚糖是一個由β-1，4或β-1，3糖苷鍵連接的高度分支的異聚多糖，主鏈由木 糖苷鍵連接吡喃木糖基而成，側枝包括乙酰基，L型阿拉伯糖基，葡萄糖醛酸基等。 與木聚糖的結構相適應，木聚糖降解酶種類豐富，完全降解木聚糖需要內切1，4-β-D- 木聚糖酶(endo-l，4-β-D-xylanohydrolase，EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(β-D-xylosidase， EC3.2.1.37)，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(a-L-arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)、a-D 葡萄糖醛酸苷酶(a-D-glucatronidase，EC3.2.1.139)等多種酶的協同作用，通過 這些酶的協同作用，木聚糖能夠有效地被水解(Collinsetal.FEMSMicrobiolRev， 2005，29:3-23)。

植食性動物胃腸道中存在豐富的與木質纖維素降解有關的多種酶類，但不同動 物之間存在差異(Hessetal.Science，2011，331:463-467；Daietal.PLoSOne，2012， 7:e40430)。研究表明，不同環境及微生物來源的木聚糖酶酶學性質差異較大(Kimura etal.BiosciBiotechnolBiochem,2000,64:1230-1237；Gessesseetal.ApplEnviron Microbiol,1998,64:3533-3535)，因此研究鑒定不同來源的木聚糖降解酶對拓寬其 應用領域具有重要意義。

胃腸道微生物群落是動物長期進化的結果，和動物的食性、機體的免疫功能、 營養需求等有著密切的關系。滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)是典型的植食性靈長 類動物，主食粗纖維食物，研究發現其腸道中存在大量能分解纖維素、半纖維素的 細菌，如纖維桿菌屬、密螺旋屬、假單胞菌屬以及瘤胃球菌屬的細菌(Xuetal.BMC Genomics,2015,16:174)，但其與纖維素降解相關酶的研究工作很少。

微生物是獲取酶的主要來源，因此分離微生物是獲取酶的首要步驟，一直以來 研究者多利用純培養技術預先從環境樣品中分離出能夠利用纖維素的微生物，再從 其體內提取相關的酶。然而，傳統的微生物純培養技術使得占微生物種類99％以上 的不可培養微生物無法分離獲得，因此通過分離培養微生物來篩選新型酶的傳統方 法大大限制了篩選的廣泛性和有效性。近年發展起來的宏基因組技術避開傳統的微 生物分離培養過程，直接研究特定環境中的基因組DNA，借助新一代測序技術和生 物信息學平臺，挖掘利用大量過去無法獲得的新基因資源。

宏基因組技術的應用拓寬了木聚糖降解酶的篩選與克隆的范圍，Gong等從奶 牛瘤胃宏基因組文庫中篩選得到高活性的GH10木聚糖酶(Gongetal,BMCResearch Notes,2012,1:566-576)，該酶在4℃時能保持25％的相對活性。Kim等從土壤宏基 因組文庫中篩選得到一種新型雙功能木聚糖酶/內切葡聚糖酶CelM2，可同時水解大 麥葡聚糖及木聚糖(Kimetal,BiochemBiophyResCommun,2009,383:183-186)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種動物糞便宏基因組來源的多功能木聚糖降解酶、其 編碼基因及其制備方法，本發明提供的多功能木聚糖降解酶同時具有木聚糖酶、木 糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低溫活性。

本發明的目的之一在于提供一種動物糞便宏基因組來源的多功能木聚糖降解 酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，共402個氨基酸，其理論分子量為47.74kDa。 本發明從滇金絲猴糞便宏基因組中得到木聚糖降解酶基因XynRBM，并將其轉入大 腸桿菌進行異源表達和重組酶的酶學特性分析，發現獲得的多功能木聚糖降解酶 XynRBM同時具有木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低溫活性， 在0℃、10℃、20℃下分別具有13.5％、46.9％、72.6％的酶活，可應用于低溫產品加 工，且本發明中的多功能木聚糖降解酶來源于動物胃腸道，因此其性質具有進一步 應用于飼料等領域的潛力。