[發明專利]一種利用方波電擊進行萊茵衣藻高效建庫的方法

有效

• 申請號: 201610020152.7
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN105543281B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 王亮;范志月;楊麗婧;楊豐源;陸軍;鄭元林
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N1/13
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種利用方波電擊進行萊茵衣藻高效建庫的方法，包括以下步驟：萊茵衣藻在TAP液體培養基，23±0.5°C，連續光照，8000Lx光強下進行通氣培養，經過轉接后培養、處理，將抗性DNA片段經過方波電擊轉化，抗性DNA隨機整合進入萊茵衣藻染色體中，經過過夜弱光恢復，涂布于抗性篩選平板，經過7天光周期培養，獲得引起隨機插入突變的突變體文庫。此方法的優點是可以高效的獲得大量隨機插入的轉化子，構建萊茵衣藻突變體文庫。

技術領域

本發明涉及一種利用方波電擊使得外源DNA整合進入萊茵衣藻染色體DNA的方法，特別是一種利用方波電擊使得抗性DNA隨機插入萊茵衣藻染色體DNA，構建隨機插入的萊茵衣藻突變體文庫的方法。

背景技術

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種真核單細胞綠藻，因其生長快、易培養，基因組小而且已被注釋，生物技術手段相對成熟，細胞內生理過程的分子機制與高等動植物高度相似，因此是目前植物與動物共同的模式生物之一。采用正向遺傳學插入突變手段研究表型與基因的關聯性，并進一步揭示該基因的生物學功能，是目前較為直接與有效的研究手段。然而該手段的關鍵在于獲得大量可以穩定遺傳的DNA片段隨機插入的突變體文庫，一方面要求單克隆轉化子的突變盡可能是單一插入引起，另外一方面要求DNA片段的轉化盡可能獲得較多的轉化子，二者是相互矛盾體，前者要求在做隨機插入突變的時候盡可能降低DNA的量，而提高轉化子數目除了提高轉化效率因素之外，增加DNA的量也可以提高轉化子的數目，從而獲得數目可觀的突變體文庫。因此，從提高DNA轉化效率入手是目前構建萊茵衣藻突變體文庫，或者是開展衣藻轉基因技術的根本。

目前的衣藻DNA轉化技術中，常用的有玻璃珠轉化，電擊轉化等。Kindle等研究者報道了萊茵衣藻的玻璃珠轉化法，該方法將去壁處理的衣藻細胞、DNA、聚乙二醇和玻璃珠震蕩混勻，可以獲得10³個轉化子/微克DNA（Kindle, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences）。因而，早期的玻璃珠轉化技術效率較低，操作較復雜，逐漸被摒棄。

電擊轉化技術被認為是一種最有效的DNA轉化技術，最成功的案例是應用在細菌上，可達10^6-10個轉化子/微克DNA。另外，RNA、DNA、蛋白質和小分子都可以使用該方法轉入酵母，植物細胞與動物細胞，具有重復性好、效率高和細胞的存活率高等優點。Shimogawara等研究者報道了萊茵衣藻的電擊轉化方法，該方法對于細胞壁缺陷細胞CC3395的轉化效率高達1.9×10⁵個，然而沒有檢測野生型衣藻的轉化效率（Shimogawara, 1998, Genetics）。同樣的，Ladygin研究發現使用細胞壁缺陷CW-15衣藻電擊轉化獲得10³個/5 ug DNA（Ladygin, 2003,Microbiology）。而方波電擊轉化技術比指數衰減波更具有良好的重復性，對細胞損傷小等特點，然而目前使用該系統電擊轉化萊茵衣藻的報道還很少，效率還不夠高。Takashi等研究者使用方波電擊儀NEPA21，采用衰減型，高低壓與正反極組合變化的方式對野生型C-9萊茵衣藻細胞進行電擊轉化，具體參數為①高壓250 V，8 ms，50 ms間隔，衰減40%為150 V，8ms；②低壓20 V，衰減40%，50 ms間隔，10次（后五次電極方向相反），將2k抗性片段經過轉化可以獲得3380個轉化子/ug DNA，C-9去細胞壁后使得其轉化效率翻倍；利用相同的電擊參數電擊轉化其他野生型萊茵衣藻CC-124，CC-125，CC-1690（21gr），分別獲得轉化子的數目是2930個轉化子/ug DNA，404個轉化子/ug DNA，3400個轉化子/ug DNA。如果將長片段7.8kb片段DNA進行轉化，則效率下降至500個轉化子/ug DNA（Takashi,2012, Journal of Bioscience and Bioengineering）。